使用化学连接和半抗原转移的邻近测定法的制作方法
发明领域
本发明涉及原位邻近测定法，具体而言使用邻近诱导的化学连接反应以形成共价键和随后转移可检测的半抗原的邻近测定法。本发明的特征还在于蛋白-蛋白相互作用、融合蛋白和蛋白翻译后修饰的检测。
发明背景
邻近测定法用于评价两个特定蛋白或其部分是否紧密邻近，例如彼此结合的蛋白，紧密邻近定位的融合蛋白和/或蛋白。一种被称为邻近连接测定法(pla)的这种测定法的特征在于与目标靶标结合的两个抗体(在不同物种中产生)(参见naturemethods3,995-1000(2006))。然后作为具有连接的独特寡核苷酸链的物种特异性二抗的pla探针与适当的一抗结合。在靶标密切邻近的情况下，pla探针的寡核苷酸链可与额外的ssdna和dna连接酶相互作用，使得它们可以经由滚环循环扩增(rca)循环和扩增。当使用高度进行性的dna聚合酶诸如phi29dna聚合酶时，环状dna模板可以复制长数百至数千倍，因此产生长度为几百纳米至微米的ssdna分子(参见angewandtechemieinternationaledition,2008,47,6330-6337)。扩增后，可以经由检测系统检测复制的dna。因此，可见信号表明目标靶标是紧密邻近的。这些测定法的特征在于使用几种dna-抗体缀合物以及酶诸如dna连接酶和dna聚合酶。这些缀合物和酶可能是昂贵的，并且它们还需要严格的测定条件以便实现正常的功能和稳定性。此外，该方法生成扩增的dna序列，尽管容易检测，但无法保持与所检测的邻近事件共定位。
用于研究蛋白-蛋白相互作用的另一种测定法包括双重结合剂(db)测定法，其利用通过柔性接头连接的具有快速解离速率动力学的两个fab片段组成的双特异性检测剂(developmentofbispecificmoleculesfortheinsitudetectionofprotein-proteininteractionsandproteinphosphorylation,chemistry&biology21,1–12,march20,2014)。原则上，因为双重结合剂包含具有快速解离速率动力学的fab片段，所以如果仅fab片段之一与其表位结合，则洗掉双重结合剂(双重结合剂的两个fab片段的同时协同结合防止双重结合剂的解离并导致阳性染色/可见性)。这些方法需要具体开发具有特异性结合动力学的fab片段，这使得将其实现至目标靶标的宽度不合理。
另一种方法，grossman等人，描述了通过将报告基团从供体探针转移至附近的接受探针来检测邻近靶核酸的测定法。探针被设计成与靶核酸的互补区段相邻地退火。探针对的退火(密切邻近)允许发生反应(例如，硫基交换反应等)，这便于报告基团(例如荧光猝灭剂)的转移(参见grossman等人,angew.chem.int.ed.2008,47,7119-7122)。
根据另一种方法，pct公开申请wo2014/139980(对于与邻近测定法和用于实现其的工具相关的公开内容，其以其整体通过引用并入本文)描述了生物素连接酶底物和酶用于进行邻近测定的用途。该方法提供了靶分子和邻近度的检测，同时维持样品的细胞环境。使用生物素连接酶诸如来自大肠杆菌的酶和用于该酶的肽底物诸如氨基酸底物提供了ffpe样品中的蛋白-蛋白相互作用的灵敏和特异性检测。因为生物素连接酶可以在生物素存在的情况下有效地生物素化适当的肽底物，并且仅当酶使得与肽底物物理接触时才可发生反应，所以生物素连接酶和底物可以分别与分别识别目标靶标的两种抗体缀合。
发明概述
本发明的特征在于用于检测靶标邻近的方法。如本文更包括性地描述，本发明的特征在于用于检测靶标邻近的方法，其中(i)化学反应步骤在一对修饰的特异性结合分子(例如，两个抗体，其各自与适于当非常接近时且在外部刺激后形成共价键(化学连接)的桥组分缀合，所述桥组分之一还包含可切割键和可检测部分)之间形成共价键，和(ii)随后/分开的切割步骤切割最初与可检测部分缔合的桥组分，使得可检测部分被最终转移至相对的特异性结合分子。可检测部分的检测表明靶标邻近，因为通过洗涤将从样品除去由于邻近不足而导致的未被接合于化学键形成中的可检测部分。
本发明的方法与显色和荧光检测系统相容，并且所述方法可以手动地或在自动化系统中进行。因为本发明的方法的特征不在于使用酶诸如dna连接酶或dna聚合酶，所以所述方法使用较少用于检测靶标邻近的灵敏和昂贵的试剂，和相对于测定条件可能具有更多的灵活性和耐受性的试剂。
重要的是，本发明的特异性结合分子(例如，抗体)可以与一个或多个(例如，二、三、四、五、6、7、8、9、10或更多个)桥组分缀合。这可以是有利的，因为多个桥组分可以提供增强(例如较暗)的信号以及实现信号的更大可能性。
本发明的用途的多样性是令人惊讶的。例如，包括的实例表明本发明可用于检测蛋白-蛋白相互作用和翻译后修饰(ptm)状态。因此，提供了用于检测各种邻近的生物学重要的靶标的方法，诸如蛋白二聚化、蛋白融合、缔合，和ptm，包括磷酸化、糖基化、泛素化、sumo化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和/或等。
本发明的范围内包括本文描述的任何特征或特征组合，条件是以任何这种组合包括的特征不是相互不一致的，如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识将显而易见。在下面的详述和权利要求中，本发明的额外优点和方面是显而易见的。
例如，在一些实施方案中，本发明的方法包括使第一修饰的结合分子与第一靶标结合以形成第一复合物，和使第二修饰的结合分子与第二靶标结合以形成第二复合物。
第一修饰的结合分子可以包含可切割桥组分(或多于一个可切割桥组分)，其中可切割桥组分包含切割位点(例如，二硫键、邻位二醇、邻位羟胺、硝基苯衍生物等)、可检测部分(例如，一个、至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个等)和第一化学连接基团(例如叠氮化物、硫酯、四唑环等)。切割位点比可检测部分和第一化学连接基团更邻近于第一修饰的结合分子。第一化学连接基团位于可切割桥组分的末端处。第一化学连接基团在生理条件下是稳定的。
第二修饰的结合分子可以包含不可切割桥组分(或多于一个不可切割桥组分)，其中不可切割桥组分包含第二化学连接基团(例如，炔基、卤素基团(-cl、-br、-i等)、烯基等)。第二化学连接基团位于不可切割桥组分的末端处。第二化学连接基团在生理条件下是稳定的。化学连接基团在第一和第二修饰的结合分子之间是可互换的。
在一些实施方案中，第一修饰的结合分子包含第一抗体，且第二修饰的结合分子包含第二抗体。在一些实施方案中，第一修饰的结合分子包含第一一抗和第一二抗，且第二修饰的结合分子包含第二一抗和第二二抗；第一二抗对第一一抗、而非第二一抗是特异性的，且第二二抗对第二一抗、而非第一一抗是特异性的；且所述可切割桥组分与第一二抗结合，且所述不可切割桥组分与第二二抗结合。
所述方法还可以包括将第一化学连接基团与第二化学连接基团共价连接以形成共价键合的单元，切割可切割桥组分的切割位点，使得共价键合的单元与第二修饰的结合分子、而非第一修饰的结合分子结合，去除不是共价键合的单元的一部分的可切割桥组分(例如洗涤)，和使可检测部分可见(例如经由显色系统、荧光系统等)。
本发明的方法可以包括使第一一抗与第一靶标结合且使第二一抗与第二个靶标结合；然后使第一二抗与第一一抗结合，且使第二二抗与第二一抗结合，其中第一二抗对第一一抗、而非第二一抗是特异性的，且第二二抗对第二一抗、而非第一一抗是特异性的。第一二抗可以是如上所述的第一修饰的结合分子，例如包含如前所述的可切割桥组分。第二二抗可以是如上所述的第二修饰的结合分子，例如包含如上所述的不可切割桥组分。所述方法还可以包括将第一化学连接基团与匹配的第二化学连接基团共价连接以形成共价键合的单元；切割可切割桥组分的切割位点，使得共价键合的单元与第二二抗、而非第一二抗结合；去除不是共价键合的单元的一部分的可切割桥组分；和使可检测部分可见。
在一些实施方案中，可检测部分的可见性表明第一靶标和第二靶标相距不超过60nm，相距不超过50nm，相距不超过40nm，相距不超过30nm，相距不超过25nm，相距不超过15nm，相距不超过10nm，相距不超过5nm等。
本发明的方法可以手动或使用自动化染色机进行。本发明的一个方面是用于进行测定的试剂和试剂盒是足够稳定的，使得它们可以用于自动化染色仪器上。例如，所述试剂可配置为在室温下具有大于1个月的保质期。
在一些实施方案中，可检测部分包含非内源化合物，肽标签(例如衍生自血凝素的ha标签、flag标签、myc标签、v5标签、e-标签、vsv标签等)或寡核苷酸。在一些实施方案中，可切割桥组分包含x个聚乙二醇基团(pegx)，其中x≥1。在一些实施方案中，不可切割桥组分包含x个聚乙二醇基团(pegx)，其中x≥1。
在一些实施方案中，将第一化学连接基团与第二化学连接基团共价连接的步骤包括使样品与催化剂(例如用于引发huisgen1,3-偶极环加成反应的铜(i))、紫外光或脱保护条件(例如肼(n2h4))接触。在一些实施方案中，化学连接基团适于在少于两小时内形成共价键合的单元。
在一些实施方案中，切割可切割桥组分的切割位点的步骤包括使样品与还原剂(例如二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(bme)或三(2-羧乙基)膦)(tcep))、高碘酸钠(naio4)或紫外光接触。在一些实施方案中，切割位点包含二硫键、邻位二醇、邻位羟胺或硝基苯基衍生物。
本发明的一个方面是测定可以在商业上合理和化学稳健的时间内进行(例如，时间足够低，使得水解和热降解的不利影响不会影响测定性能-更短时间的主要原因更多是由于提高的测试效率)。在一些实施方案中，化学连接基团适于在少于4小时、3小时、2小时或1小时内形成共价键合的单元。
本发明的特征还在于用于检测靶标接近的组合物，例如用于本文所述的方法中的组合物。例如，本发明的特征在于包含如本文所述的可切割桥组分的组合物。组合物还可以包含与可切割桥组分缀合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与至少一个可切割桥组分缀合。在一些实施方案中，所述抗体与至少两个可切割桥组分、至少五个可切割桥组分、至少十个可切割桥组分或至少十五个可切割桥组分缀合。本发明的特征还在于包含如本文所述的不可切割桥组分的组合物。组合物还可以包含与不可切割桥组分缀合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与至少一个不可切割桥组分缀合。在一些实施方案中，所述抗体与至少两个不可切割桥组分、至少五个不可切割桥组分、至少十个不可切割桥组分或至少十五个不可切割桥组分缀合。
还公开了用于实施所公开的实施方案的试剂盒。例如，本发明的特征在于包含如本文所述的第一修饰的结合分子和/或第二修饰的结合分子的试剂盒。所述试剂盒还可以包含有效地将第一化学连接基团与第二化学连接基团共价连接以形成共价键合的单元的催化剂。在一些实施方案中，化学连接基团适于在少于4小时、3小时、2小时或1小时内形成共价键合的单元。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于切割可切割桥组分的切割位点的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于使可检测部分可见的系统。
在一些实施方案中，第一靶标包含靶蛋白，且第二靶标包含翻译后修饰(例如磷酸化、泛素化、糖基化、泛素化等)。因此，本发明的测定可用于原位检测具有翻译后修饰(例如磷酸化、泛素化、糖基化、泛素化等)的靶蛋白。
附图简述
图1a-图1c是修饰的特异性结合部分的示意图。图1a和图1b显示特异性结合部分和可切割桥组分的示意图。所述可切割桥组分包含切割位点(可切割接头)、可检测部分(半抗原)和化学连接基团(cl)。半抗原(可检测部分)和化学连接基团可以是直链或支链排列的。可以在所有三种官能团间使用接头。可切割接头比其他两个基团更邻近于特异性结合部分。图1c显示特异性结合部分(例如抗体)和不可切割桥组分。所述可切割桥组分包含接头和化学连接基团(cl)。
图2显示化学连接反应性基团(cl-a和cl-b)的非限制性示例性结构和形成共价键的相应条件。
图3是显示参与根据本公开的邻近测定法的概念和主要步骤的示意图。顶部显示系统中的邻近测定法，其中两个目标靶标密切邻近。底部显示系统中的邻近测定法，其中两个目标靶标不密切邻近。本发明不限于图3中所述的组分和步骤。
图4是显示包含具有可切割桥组分的抗体的抗体缀合物的非限制性实例(上图)和包含不可切割桥组分的抗体缀合物的非限制性实例(底图)的示意图。
图5显示替代可切割桥组分(三官能分子)，其中可切割桥组分包含支架，并且可检测部分/半抗原与支架结合。
图6是显示使用本发明的测定法检测蛋白翻译后修饰(ptm)、诸如磷酸化或泛素化的示意图。
图7是显示山羊抗兔(gar)与可切割桥组分的缀合物a的合成的示意图，所述可切割桥组分包含peg8接头、二硫键、血凝素标签(ha-标签)作为半抗原以及叠氮基(n3)。
图8是显示图7的gar-ha肽缀合物的纯化的代表性sec色谱图。
图9是显示使用市售dab显色检测系统使用ihc方法检测可检测部分/半抗原ha-标签的显微照片。
图10是显示用于检测可检测部分/半抗原的邻近测定和随后的免疫组织化学测定法，以及使用荧光团-酪酰胺(cy5-tyr)检测方法的替代检测方法的步骤的流程图。
图11是显示用于确定用于从缀合物a完全切割ha-标签的条件的步骤的流程图(参见实施例3)。
图12a-12d是显微照片，其显示如实施例3中所述使用各种浓度的二硫苏糖醇(ddt)、无dtt(图12a)、50mmdtt(图12b)、75mmdtt(图12c)和100mmdtt(24分钟dtt孵育，使用半抗原-酪酰胺扩增(hq-tyramp))(图12d)测定ki67后染色的扁桃体组织载片，进行所述实施例3以建立足以原位切割的dtt浓度。
图13a和图13b是显微照片，其显示如实施例3中所述显示无dtt(图13a)和50mmdtt(24分钟dtt孵育，使用半抗原-酪酰胺扩增(hq-tyramp))(图13b)的情况下使用可切割桥组分进行e-钙粘蛋白(e-cad)测定的染色的皮肤组织切片。
图14a-图14c是显示扁桃体切片中cd20的检测的显微照片，其显示cu(i)/l比率和伴随染色的影响。图14a显示1:5的cu(i)/比率，图14b显示1:3的cu(i)/l比率，且图14c显示不添加cu(i)的对照。使用gam-peg4-cch的缀合物中的反应性乙炔基(参见实施例3)。当添加cu(i)时，实现了cd20的特异性检测。当省略cu时，没有观察到染色。这表明在gam缀合物中存在反应性乙炔官能团。
图15a和15b是显微照片，其显示使用商业dab显色检测用cu(i)(图15a)和无cu(i)(图15b)检测正常扁桃体组织切片中的e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)。
图16a-图16d是显微照片，其显示用市售的半抗原-酪酰胺扩增(ventanaoptiview扩增试剂盒)检测正常扁桃体组织切片中的e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)，其显示省略小鼠抗β-cat的邻近测定法(图16a)、省略兔抗e-cad的邻近测定法(图16b)、用cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat邻近测定法(图16c)和排除cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat邻近测定法(图16d)。
图17a-图17d是显微照片，其显示用于使用cu(i)和ventanaoptiviewdab以及ventana扩增试剂盒检测正常扁桃体切片载片中的e-钙粘蛋白(e-cad)和p120-联蛋白(p120)的邻近的测定法(图17a)，且显示不包括cu(i)的阴性对照(图17b)。图17c和图17d是切片的显微照片，其中用如本文所述的邻近测定(图17c)和排除cu(i)的邻近测定(图17d)使用结合正常扁桃体组织切片中的蛋白的不同表位的小鼠抗ecad和兔抗ecad一抗检测e-钙粘蛋白。
图18a-图18d是显微照片，其显示用扩增检测用ventanaoptiviewdab染色的正常皮肤组织切片中的e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)，其中图18a显示e-cad和β-cat之间的邻近测定，且图18b是其中排除cu(i)的对照。图18c还显示不同皮肤切片中的e-cad和β-cat之间的邻近测定，且图18d是其中排除cu(i)催化剂的相应阴性对照。
图19a-图19c是显示使用cy5-tyr的正常扁桃体切片中的ecad/β-cat的基于荧光团-酪酰胺的检测的显微照片(蓝色=dapi，红色=用于ecad/β-cat的cy5)。
图20a-图20d是显微照片，其显示用扩增的用ventanaoptiviewdab染色的正常扁桃体组织切片中的cd19/cd21的邻近测定。图20b是图20a的对照，其中排除cu(i)。图20c显示在正常扁桃体组织中通过使用小鼠抗cd21和兔抗cd21一抗检测cd21，且图20d是图20c的对照，其中排除cu(i)。
图21a-图21c是显示用于使用抗her2(克隆4b5)和检测磷酸化的抗p-tyr抗体来检测her2磷酸化的邻近测定的显微照片。组织来自使用dab显色检测的3合1异种移植物载片，其中图21a显示仅添加抗her2抗体，图21b显示使用抗her2(克隆4b5)和抗p-tyr抗体与cu(i)的邻近测定，且图21c显示图21b的对照，其中排除cu(i)。
图22是使用如本文所述的测定法检测蛋白的泛素化的示意图。
图23a-图23d是显示检测mcf-7异种移植物中的孕酮受体(pr)的泛素化的显微照片。mcf-7细胞是pr阳性的。图23a显示pr和泛素之间的邻近测定。图23b是没有cu(i)催化剂的邻近测定的对照。图23c和图23d是各自使用市售的ventanaultraviewdab检测法检测的pr(图23c)和泛素(图23d)的标准ihc检测。
图24a-图24d是显示检测zr-7551异种移植物中的孕酮受体(pr)的泛素化的显微照片。zr-751细胞是pr阳性的。图24a显示pr和泛素之间的邻近测定。图24b是没有cu(i)催化剂的邻近测定的对照。图24c和图24d是各自使用市售的ventanaultraviewdab检测法检测的pr(图24c)和泛素(图24d)的标准ihc检测。
图25a-图25d是显微照片，其中图25a与图24a相同，除了其显示划分为(b)-(d)的区域，其在图25b-图25d的显微照片中以更高的放大率显示。更高的放大率更容易显示泛素化的pr的异质性。
图26a-图26d是显示未检测到calu-3异种移植物中的孕酮受体(pr)的泛素化的显微照片。calu-3细胞是pr阴性的。图26a显示缺乏pr和泛素之间的邻近测定的信号。图26b是没有cu(i)催化剂的邻近测定的对照。图26c和图26d是各自使用市售的ventanaultraviewdab检测法检测的pr(图26c)和泛素(图26d)的标准ihc检测。
图27a-图27c是显示检测calu-3细胞中her2的泛素化的显微照片。calu-3细胞是her2阳性的。图27a显示her2和泛素之间的邻近测定。图27b是没有cu(i)催化剂的邻近测定的对照。图27c显示图27a在更高放大率下的区域。在calu-3细胞中检测到泛素化的her2。
图28a-图28d是显示使用本发明的邻近测定法检测mlh1-pms2异源二聚体的显微照片。图28a显示使用兔抗pms2mab的hela细胞异种移植物中pms2的标准ihc。图28b显示使用小鼠抗mlh1mab的hela细胞异种移植物中mlh1的ihc。图28c显示mlh1-pms2异源二聚体的邻近测定，且图28d是没有cu(i)催化剂的邻近测定的对照。
优选实施方案的描述
i.术语
除非另有说明，否则技术术语根据常规用途使用。分子生物学中常用术语的定义可见于benjaminlewin,genesv,由oxforduniversitypress出版,1994(isbn0-19-854287-9);kendrew等人(编),theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellscienceltd.出版,1994(isbn0-632-02182-9);和roberta.meyers(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由vchpublishers,inc.出版,1995(isbn1-56081-569-8)。除非另有解释，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指出。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另有明确指出。还应当理解，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似的，并且提供用于描述。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于实施或测试本公开，但合适的方法和材料在下文中描述。术语“包含”意指“包括”。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其整体或者对于其参考文献的上下文内相关的该部分通过引用并入本文。所有genbank登录号通过引用并入本文，因为它们在2011年6月8日出现在数据库中。在冲突的情况下，将以本说明书，包括术语的解释，为准。此外，材料、方法和实例是说明性的，并不旨在进行限制。
为了便于综述本公开的各个实施方案，提供了以下特定术语的解释：
施用：通过任何有效的途径向受试者提供或给予试剂，例如组合物。示例性的施用途径包括但不限于口服、注射(诸如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、经皮(例如局部)、鼻内、阴道和吸入途径。
试剂：可用于实现目标或结果的任何物质或任何物质组合；例如，可用于降低或降低蛋白-蛋白相互作用的物质或物质组合。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂，诸如用于治疗癌症的治疗剂。
抗体：包括至少特异性结合抗原的表位或其片段的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体包括完整免疫球蛋白及其本领域众所周知的变体，诸如fab'、f(ab)'2片段、单链fv蛋白(scfv)和二硫化物稳定的fv蛋白(dsfv)。scfv蛋白是融合蛋白，其中抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区通过接头结合，而在dsfv中，链已被突变以引入二硫键以稳定链的缔合。该术语还包括遗传工程改造的形式，诸如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合物抗体(诸如双特异性抗体)。还参见，piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,il);kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,newyork,1997。
本文公开的抗体特异性结合限定的靶标(或在双特异性抗体的情况下，多个靶标)。因此，特异性结合靶标的抗体是基本上结合靶标(例如表达靶标的细胞或组织)的抗体。当然，认识到在抗体和非靶标之间可存在一定程度的非特异性相互作用。
通常，特异性结合导致抗体与携带抗原的蛋白或细胞之间的缔合比在抗体和缺乏抗原的蛋白或细胞之间的缔合强得多。特异性结合通常导致抗体(每单位时间)与包括表位的蛋白或表达靶表位的细胞或组织结合的量相比于缺乏该表位的蛋白或细胞或组织增加大于2倍、诸如增加大于5倍、大于10倍或大于100倍。在此类条件下与蛋白的特异性结合需要针对其对特定蛋白的特异性选择的抗体。各种免疫测定形式适用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，固相elisa免疫测定通常用于选择与蛋白特异性免疫反应的单克隆抗体。对于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见harlow&lane,antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborpublications,newyork(1988)。
生物样品：包含生物分子，包括基因组dna、rna(包括mrna和微rna)、核酸、蛋白、肽和/或其组合，的生物样本。在一些实例中，生物样品获得自受试者。在其他实例中，生物样品是细胞培养物，包括从获得自受试者的生物样品生长的细胞培养物。生物样品包括可用于检测受试者中的疾病(例如癌症)的所有临床样品，包括但不限于，细胞、组织和体液，诸如血液、血液的衍生物和级分(诸如血清)；以及活检或外科手术取出的组织，例如未固定、冷冻或在福尔马林或石蜡中固定的组织。在具体实例中，生物样品获得自具有或怀疑具有肿瘤的受试者；例如，具有或怀疑具有乳腺癌、卵巢癌、胃癌或子宫癌的受试者。在一些实施方案中，所述受试者具有或怀疑具有癌。
缓冲液：缓冲溶液通常用于维持生物和化学体系的正确ph水平。本文公开的许多示例性实施方案包括使用缓冲溶液。可能存在于缓冲液中的代表性缓冲剂或盐包括但不限于tris、tricine、hepes、mops、taps、bicine、tapso、tes、pipes、卡可酸盐、ssc、mes、kcl、nacl、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、nh4cl、硫酸铵、mgcl2、乙酸镁等。一种缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。另一种缓冲溶液是生物素连接酶反应缓冲液(0.1mkcl，5.5mmmgcl2，50mmtris·hcl(ph=8.0)，0.05%brij-35，0.1mm二硫苏糖醇(dtt)，3mmatp和60μm生物素)。缓冲剂的量通常范围为约5至150mm，通常约10至100mm，更通常约20至50mm，其中在某些优选实施方案中，缓冲剂将以足以提供在室温下范围为约6.0-约9.5的ph、更通常约6.5-约7.4的ph范围的量存在。可存在于缓冲介质中的其他试剂包括螯合剂，诸如edta、egta等。
显色染色：显色底物已广泛用于免疫组织化学多年，最近用于原位杂交。显色检测提供了一种简单且成本划算的检测方法。传统上，显色底物当通过适当酶作用时通过沉淀起作用。也就是说，传统的显色物质在与酶接触后从可溶性试剂转化为不溶的有色沉淀物。所得有色沉淀物不需要特殊设备用于处理或显现。存在成功的ihc或ish显色底物共享的几个品质。首先，物质应该沉淀为有色物质，优选具有非常高的摩尔吸光度。酶底物应当具有高溶解度和试剂稳定性，但沉淀的色原产物应当非常不溶，优选在水溶液和醇溶液中非常不溶。酶转换率应当非常高，以便在短时间内高度扩增来自单一酶的信号。到目前为止，已经鉴定了合理地具有所有这些品质的相对少量的显色物质。参考于2014年2月24日提交的题为quinonemethideprecursorsandusestherefore的美国公开申请号2013/0260379和61/943,940，其对于与显色染色相关的公开内容以其整体在此通过引用并入本文。几种市售的显色检测试剂盒可得自ventanamedicalsystems,inc.且在本文提及(aec检测试剂盒760-020；增强的碱性磷酸酶红色检测试剂盒760-031；optiviewdabihc检测试剂盒760-700；iviewdab检测试剂盒760-091；ultraview通用碱性磷酸酶红色检测试剂盒760-501；和ultraview通用dab检测试剂盒760-500)。
缀合物：例如通过共价键或非共价相互作用偶联在一起的两个或更多个分子。
缀合、接合、键合或连接：将第一分子与第二分子偶联。这包括但不限于将一个分子与另一分子共价键合，将一个分子与另一分子非共价键合(例如静电键合)(参见例如美国专利号6,921,496)，氢键键合，范德华力，以及此类偶联的任何和所有组合。
接触：置于直接缔合中，例如固体、液体或气体形式。
对照：用于与测试样品比较的样品或标准品，例如生物样品，例如获得自患者(或多个患者)或细胞培养物的生物样品。在一些实施方案中，未与测试试剂孵育的细胞培养物充当与测试试剂孵育的细胞培养物的对照。在一些实施方案中，对照是获得自健康患者(或多个患者)的样品(本文也称为“正常”对照)，诸如正常乳腺样品。在一些实施方案中，对照是历史对照或标准值(即，先前测试的对照样品或代表基线或正常值的样品组)。在一些实施方案中，对照是代表获得自多个患者样品的平均值(或值的平均范围)的标准值。
偶联的：直接或间接接合在一起的两个或更多个分子。第一原子或分子可直接偶联或间接偶联至第二原子或分子。当与结合至抗原的一抗结合时，二抗与抗原间接偶联。
检测：鉴定某物的存在(existence)、发生、存在(presence)或事实。一般检测方法是本领域普通技术人员已知的，并且可以用本文公开的方案和试剂来补充。例如，本文包括检测生物样品中邻近于第二靶标的第一靶标的方法。
ffpe：福尔马林固定、石蜡包埋的样品。
半抗原：半抗原是分子，通常是小分子，其可以与抗体特异性组合，但通常除了与载体分子组合外，基本上不能具有免疫原性。许多半抗原是已知的并且经常用于分析程序，诸如二硝基苯基、生物素、洋地黄毒苷、荧光素、若丹明或其组合。其他半抗原已由本申请的受让人ventanamedicalsystems,inc.特别开发，包括选自以下的半抗原：噁唑类、吡唑类、噻唑类、硝基芳基类、苯并呋喃类、三萜类、脲类、硫脲类、鱼藤酮类、香豆素类、环木脂体类(cyclolignans)及其组合，其中半抗原类的具体半抗原实例包括苯并呋咱、硝基苯基、4-(2-羟基苯基)-1h-苯并[b][1,4]二氮杂䓬-2(3h)-酮和3-羟基-2-喹喔啉甲酰胺。多种不同的半抗原可以偶联至聚合物载体。此外，化合物、诸如半抗原，可以使用接头、诸如nhs-peg接头偶联至另一个分子。
免疫复合物：抗体与可溶性抗原的结合形成免疫复合物。可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法检测免疫复合物的形成，例如免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微镜、elisa、免疫印迹(即western印迹)、磁共振成像、ct扫描、x-射线和亲和色谱。可以使用本领域众所周知的方法来定量所选抗体的免疫结合特性。
接头：两个组分可以直接通过键或间接通过接头连接在一起。接头可以是双官能的，即接头在每个末端包括官能团，其中官能团用于将接头共价或非共价连接至两个组分。两个官能团可以相同，即同双官能接头，或不同的，即异双官能接头，但更通常为异双官能的。在采用接头的情况下，选择合适的官能团以允许附接两个组分，同时不损害组分的官能度。目标接头可以根据缀合物中的组分而广泛变化。在许多实施方案中，当存在时，接头是生物惰性的。
可以使用接头将可切割桥组分的可检测部分和/或化学连接基团和/或切割位点连接至特异性结合分子(或将不可切割桥组分的化学连接基团连接至特异性结合部分)。可以选择不同长度的接头。在采用接头的情况下，可以选择此类基团以允许附接缀合物的两个组分，同时不损害它们的官能度。此类末端官能团包括例如但不限于胺类、醇类、硫醇类、酰肼类、羰基反应性基团(诸如醛类、酸类和酯类)、乙烯基酮类、环氧化物类、异氰酸酯类、马来酰亚胺类)、能够环加成反应、形成二硫键、结合金属或光反应性基团的官能团。具体实例包括伯胺和仲胺类、异羟肟酸类、n-羟基琥珀酰亚胺基酯类、n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯类、氧基羰基咪唑类、硝基苯基酯类、三氟乙酯类、缩水甘油醚类、乙烯基砜类和马来酰亚胺类。这些基团便于与特异性结合部分和其他所需化合物的偶联。在一些实施方案中，所述接头为至少约25道尔顿、至少约50道尔顿、至少约100道尔顿或至少约500道尔顿(或更大)。第一类接头可以是脂族化合物，诸如具有一个或多个不饱和位点的脂族烃链或烷基链。链的长度可以变化，但通常具有约30个原子的较高实用限值。已证明大于约30个碳原子的链长比具有较小链长的化合物的效力更差。因此，脂族链接头通常具有约1个碳原子至约30个碳原子的链长。然而，本领域普通技术人员将理解，如果特定接头具有大于30个原子且缀合物仍根据需要起作用，则此类链长仍然在本发明的范围内。
在一些实施方案中，接头是用反应性基团(诸如氨基-或巯基-烃)官能化的直链或支链烷基链，其中在非支链中具有多于两个碳原子。实例包括氨基烷基、氨基烯基和氨基炔基。或者，接头是长度为10-20个碳的烷基链，并且可以通过si-c直接键或通过酯si-oc键连接(参见foote的美国专利号5,661,028，其通过引用并入本文)。其他接头是本领域普通技术人员可得且是已知的(参见例如美国专利号5,306,518、4,711,955和5,707,804；其各自通过引用并入本文)。
第二类接头包括环氧烷。环氧烷在本文中通过参考二醇类、诸如乙二醇类来表示。本领域普通技术人员将理解，随着氧原子数增加，化合物的亲水性也可增加。因此，本发明的接头通常具有(-och2ch2-)n的式，其中n为约2至约20，但更具体地n为约2至约10，甚至更通常为约4至约8，其可以表示为peg4至peg8。
可用于实施本发明的某些公开的实施方案的接头，诸如异双官能聚亚烷基二醇接头，描述于受让人的共同未决申请，包括2006年4月28日提交的"nanoparticleconjugates"，美国专利申请号11/413,778；2009年3月13日提交的"antibodyconjugates"，美国申请号12/381,638；和2010年1月14日提交的“molecularconjugate”，美国专利申请号12/687,564，以及美国专利号7,695,929；其各自通过引用并入本文。在这些申请中公开的接头可用于以任何和所有期望的组合连接特异性结合部分、生物素连接酶、生物素连接酶底物、信号生成部分和半抗原以形成用于与本发明的公开实施方案使用的缀合物。
接头的其他实例包括但不限于肽，包括天然和非天然多肽，碳水化合物，环状或非环状系统，其可能含有杂原子。接头基团还可以包含与金属结合的配体，使得金属离子的存在配位两个或更多个配体以形成复合物。在另一个实施方案中，接头是一对彼此具有高亲和力的分子。此类高亲和力分子包括例如链霉抗生物素蛋白和生物素、组氨酸和镍(ni)以及gst和谷胱甘肽。
具体的示例性接头包括：乙二醇、聚亚烷基二醇诸如peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19、peg20、1,4-二氨基己烷、二甲苯二胺、对苯二甲酸、3,6-二氧杂辛二酸、乙二胺-n,n-二乙酸、1,1'-亚乙基双(5-氧代-3-吡咯烷甲酸)、4,4'-乙烯二哌啶、琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺(s-hynic、hynic-nhs)、n-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸酯(s-4fb、4-fb-nhs)、马来酰亚胺hynic(mhph)、马来酰亚胺4fb(mtfb)、琥珀酰亚胺基-[(n-马来酰亚胺基丙酰胺基)-八乙二醇]酯(mal-peg8-nhs)、琥珀酰亚胺基-[(n-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(mal-peg4-nhs)、4-fb-peg4-pfp、叠氮基苯甲酰肼、n-[4-(p-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫基]丙酰胺)、辛二酸双磺基琥珀酰亚胺酯、二甲基己二亚氨酯(dimethyladipimidate)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、n-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、n-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、n-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、n-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亚胺基-4-[n-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-甲酸酯、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(spdp)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(smcc)等。
可以构建融合蛋白，而不是化学接头(例如，可以在基因水平上将肽与特异性结合分子偶联)。
核酸：经由磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其相关天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物)、其相关天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的键包括非天然存在的合成类似物，诸如例如、但不限于硫代磷酸酯类、氨基磷酸酯类、甲基膦酸酯类、手性甲基膦酸酯类、2-邻甲基核糖核酸类、肽-核酸(pna)等。此类多核苷酸可以例如使用自动化dna合成仪合成。应当理解，当核苷酸序列由dna序列(即a、t、g、c)表示时，这也包括其中“u”替代“t”的rna序列(即a、u、g、c)。
核苷酸：术语包括但不限于与糖连接的碱基，诸如嘧啶、嘌呤或其合成类似物，或与氨基酸连接的碱基，如肽核酸(pna)中。核苷酸是多核苷酸中的一个单元。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。
本文中使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左侧末端是5'末端；双链核苷酸序列的左侧方向被称为5’-方向。向新生rna转录物5’至3’添加核苷酸的方向被称为转录方向。与mrna具有相同序列的dna链被称为“编码链”；dna链上与从该dna转录的mrna具有相同序列且位于rna转录物的5’-末端的5’的序列被称为“上游序列”；dna链上与rna具有相同序列且在编码rna转录物的3’-末端的3’的序列被称为“下游序列”。
寡核苷酸：长度为5至100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。
邻近：是指两个分子/靶标/表位之间的定性或定量距离；例如，组织样品中两个蛋白之间的距离。在一些实施方案中，彼此邻近的分子在彼此的约100nm、约75nm、约50nm、约35nm、约30nm、约25nm、约20nm、约15nm、约10nm、约5nm或以下距离内。邻近也可提供功能关系。例如，对于待键合至与第二靶标缔合的组分的与第一靶标缔合的组分，如果第一靶标在第二靶标的足够距离内，则两个靶标(例如两个蛋白)可以被认为是邻近的。邻近的另一功能定义是两个蛋白的二聚化。邻近的另一功能定义与遗传易位相关。当基因组的两个部分彼此相邻或在彼此的500,000bp内、100,000bp内、50,000bp内、25,000bp内、10,000bp内或1,000bp内时，它们可认为是邻近的。这与由于易位(移动至另一染色体或反转)而不邻近的两个部分形成对比。术语邻近还包括作为能够进行生物学重要相互作用的分子之间的距离的功能含义。例如，具有生物学意义的蛋白二聚体中的两个蛋白之间的距离可以说是邻近的。
样品：某些公开的实施方案利用生物样品。生物样品通常获得自目标哺乳动物受试者，诸如人。所述样品可以是任何样品，包括但不限于来自活检、尸检和病理样本的组织。生物样品还包括组织切片，例如对于组织学目的所取的冷冻切片。生物样品还包括细胞培养物或细胞培养物的部分，例如从取自受试者的生物样品生长的细胞培养物。
可以使用本领域已知的任何方法从受试者获得生物样品。例如，可以从已经历作为治疗形式的肿瘤切除的乳腺癌患者获得组织样品。从这些患者可以获得肿瘤组织和周围的非癌组织。在一些实施方案中，从尸体获得用作对照的非癌组织样品。在一些实施方案中，通过活检获得生物样品。活检样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的，诸如福尔马林固定和石蜡包埋的。可以通过外科手术、通过提取(例如通过皮下针或其他类型的针)、通过显微解剖、通过激光捕获或通过本领域已知的任何其他方式从患者移取样品。
特异性结合部分：特异性结合对的成员。特异性结合对是分子对，其特征在于它们彼此结合以实质上排除与其他分子的结合(例如，特异性结合对可具有为结合对的两个成员中任一个与生物样品中的其他分子的结合常数的至少103倍、104倍或105倍的结合常数)。用于制备本文公开的示例性缀合物的特异性结合部分可以是各种不同类型的分子中的任一种，只要其对靶标展现必需的结合亲和力。
特异性结合部分可以包含小分子或大分子。小分子大小范围为约50至约10,000道尔顿，更通常约50至约5,000道尔顿，甚至更通常约100至约1000道尔顿。大分子是分子量通常大于约10,000道尔顿的分子。小分子可以是任何分子，通常是能够与靶标以必需亲和力结合的有机分子。小分子通常包括一个或多个官能团，其允许其与靶标相互作用，例如通过疏水、亲水、静电或共价相互作用与靶标相互作用。当靶标是蛋白、脂质或核酸时，小分子通常将包括官能团，其允许结构相互作用，诸如氢键键合、疏水-疏水相互作用、静电相互作用等。小分子配体通常包括胺、酰胺、巯基、羰基、羟基或羧基，且优选这些官能团中的至少两个。
小分子通常包含环状和/或杂环非芳族结构，和/或被一个或多个上述官能团取代的芳族或多芳族结构。还有用的小分子包括在生物分子间发现的结构，所述生物分子包括肽类、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、其衍生物、结构类似物或其组合。
小分子可以衍生自天然存在或合成的化合物，其可以获得自各种各样来源，包括合成或天然化合物的文库。例如，许多方法可用于随机和定向合成各种各样的有机化合物和生物分子，包括制备随机化寡核苷酸和寡肽。或者，可以得到或容易地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。此外，天然或合成产生的文库和化合物通过常规的化学、物理和生物化学方式容易地修饰，并且可用于产生组合文库。已知的小分子可以进行定向或随机化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
因此，小分子可以获得自天然存在或合成的分子文库，包括通过组合方式产生的化合物文库，即化合物多样性组合文库。当获得自此类文库时，所用的小分子将在方便的结合亲和力测定中已经证明了对靶标的一些所需亲和力。组合文库以及其生产和筛选方法是本领域已知的，且描述于美国专利号5,741,713和5,734,018，其公开内容通过引用并入本文。关于特异性结合部分的额外信息由受让人的美国专利号7,695,929(其也通过引用并入本文)提供。特异性结合部分可以包含大分子。作为大分子特异性结合部分特别感兴趣的是抗体，以及其结合片段及其衍生物或模拟物。因此，特异性结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体。还感兴趣的是重组或合成产生的抗体片段或衍生物，诸如单链抗体或scfv，或其他抗体衍生物，诸如嵌合抗体或cdr移植的抗体，其中此类重组或合成产生的抗体片段保留上述抗体的结合特征。本发明的此类抗体片段、衍生物或模拟物可以使用任何方便的方法，诸如美国专利号5,851,829和5,965,371(其公开内容通过引用并入本文)中公开的方法，容易地制备。
还适合用作大分子特异性结合部分是多核酸适体。多核酸适体可以是以与受体或抗体相同的方式更高选择性结合蛋白的rna寡核苷酸(conrad等人,methodsenzymol.(1996),267(combinatorialchemistry),336-367)或互补特异性dna靶序列的dna寡聚体。
除了基于抗体的肽/多肽或基于蛋白的结合结构域以外，特异性结合部分还可以是凝集素、可溶性细胞表面受体或其衍生物、来自噬菌体展示或核糖体展示或任何类型的组合肽或蛋白文库的亲和体或任何组合衍生的蛋白或肽。可以使用任何特异性结合部分的组合。
重要的是，特异性结合部分将是允许偶联至缀合物的第二组分或接头、而实质上不影响特异性结合部分与其靶标的结合亲和力的部分。
特异性结合部分的具体实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白诸如链霉抗生物素蛋白和蛋白a)。特异性结合部分还包括被此类特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
靶标：测定或可以测定其存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白和半抗原，诸如共价键合至蛋白的半抗原。通常使用特异性结合分子和可检测标记的一种或多种缀合物来检测靶分子。特异性靶标的实例包括蛋白、碳水化合物或核酸分子。靶核酸分子包括寻求其邻近、重排、扩增、缺失、检测、定量、定性检测或其组合的那些分子。例如，靶标可以是核酸分子的限定区域或特定部分，例如基因组的一部分(诸如基因或含有目标基因(或其部分)的dna或rna的区域)。所述核酸分子不需要是纯化形式。各种其他核酸分子也可以与靶核酸分子一起存在。例如，靶核酸分子可以是特异性核酸分子(其可以包括rna或dna)，其至少一部分(诸如基因组序列或cdna序列的一部分)的扩增是预期的。在一些实例中，靶核酸包括病毒核酸分子或细菌核酸分子，诸如来自大肠杆菌或霍乱弧菌的核酸分子。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法，诸如通过使用市售纯化试剂盒等进行。
酪酰胺信号扩增：利用过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)的催化活性以原位生成靶分子(诸如蛋白或核酸序列)的高密度标记的酶介导的检测方法。tsa通常涉及三个基本步骤：(1)特异性结合成员(例如抗体)与靶标结合，随后用第二过氧化物酶标记的特异性结合成员二次检测特异性结合成员；(2)通过过氧化物酶活化多个拷贝的标记的酪酰胺衍生物(例如半抗原标记的酪酰胺)；和(3)将所得高度反应性的酪酰胺自由基与邻近于过氧化物酶-靶标相互作用位点的残基(例如，蛋白酪氨酸残基的苯酚部分)共价偶联，导致半抗原邻近(扩散和反应性介导的)沉积至靶标。在tsa的一些实例中，涉及更多或更少的步骤；例如，可以相继重复tsa方法以增加信号。进行tsa的方法和用于进行tsa的商业试剂盒和试剂是可得的(参见例如，ventana扩增试剂盒，目录号760-080，具有tsa™的ampmap检测试剂盒，目录号760-121,ventanamedicalsystems,tucson,az;invitrogen;试剂盒编号t-20911,invitrogencorp,carlsbad,ca)。在一些实施方案中，tsa是提供的ptdm的组分。可以替代地使用其他酶催化的半抗原或信号传导连接的反应性物质，因为它们可变得可用。适用于tsa的条件以及用于酪酰胺信号扩增的试剂和试剂盒是本领域普通技术人员已知的(参见例如，bobrow等人,j.immuno.meth.,125:279-285,1989)。
在足以…的条件下：用于描述允许所需活性的任何环境的短语。
ii.实施方案的描述
现在参考图1-28，本发明的特征在于用于检测(原位)两个目标靶标是否密切邻近的邻近测定方法。本发明的方法的特征在于共价键形成。本发明的方法与显色和荧光检测系统相容。本发明的方法可以手动进行，或者所述方法可以是自动化的(例如，使用自动化染色仪器，诸如benchmarkxt,ventanamedicalsystems,inc.,tucson,az)或其组合。例如，测定可以是自动化的，但包括其中用户添加试剂的一个或多个手动步骤。不希望将本发明限于任何理论或机制，据信本发明方法中涉及的全部或大部分组分是易于获得和便宜的常用化学试剂。此外，用于测定中的缀合物的合成也可以是简单和/或高产率的(类似于抗体的半抗原标记)。
本发明的方法还可用于进行多重测定，其中在同一载片上检测多于一个邻近事件(例如，两个、三个、四个等)。在还有其他实施方案中，一个或多个邻近测定法可以与单一测定法(例如，与er、pr、ki-67蛋白或her2dish基因测定法复用的her2-her3二聚体的邻近测定法)复用。
本发明的方法的特征在于使用与可切割桥组分缀合的特异性结合部分(例如抗体)(缀合物a)以及与不可切割桥组分缀合的其他特异性结合部分(例如，抗体)(缀合物b)。可切割桥组分在其末端处或附近包含可检测部分(例如半抗原)，以及切割位点和化学连接基团。不可切割桥组分在其末端处或附近包含化学连接基团。图3显示特异性识别且结合至与目标靶标结合的一抗的示例性缀合物(缀合物a、缀合物b)。或者，缀合物可以直接结合至目标靶标。例如，缀合物可以使用一抗制备。类似地，缀合物可以包括在三级或四级检测叠层中。示例性缀合物可以包括抗物质抗体或抗半抗原抗体。缀合物进行外部刺激(例如，催化剂或其他机制诸如uv光、脱保护条件等)，其中如果两个缀合物(缀合物a、缀合物b)密切接近，则在两个抗体缀合的桥组分之间经由化学连接基团形成共价键。随后，可切割桥组分经由切割位点被切割，使得键合的桥组分仅与具有不可切割桥组分的抗体连接。在洗涤步骤之后，可以经由检测系统诸如免疫组织化学系统或荧光系统(或其他适当的检测系统)检测可检测部分。如果缀合物(缀合物a、缀合物b)不密切邻近，则在两个桥组分之间不形成共价键；当切割反应发生时，可切割桥组分(具有可检测部分)从结合部分切割，并且在洗涤步骤之后不能经由检测系统检测。因此，可检测部分的检测表明两个目标靶标的邻近。
在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过40nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过35nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过30nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过25nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过15nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过10nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过5nm。在一些实施方案中，可检测部分的检测表明靶标相距不超过2nm。本发明的一个方面是使用邻近测定可检测的距离可以针对特定的一组靶标而定制。例如，通过改变接头或桥长度，通过改变检测叠层方法(例如缀合物是一级、二级、三级或四级检测分子)，或通过在检测叠层内使用半抗原-酪酰胺扩增步骤，可针对特定应用根据需要改变使用本文的方法和试剂可检测的距离。
本发明中使用的化学品(例如，用于两个桥组分之间的共价键形成)是生物正交的(例如，非扰动或不被生物系统扰乱)。也就是说，在缀合物之间形成共价键的条件不是天然的，因此不会自发地或非特异性地发生。本发明不限于本文所述的化学品(参见patterson等人,acschemicalbiology2014,9,592-605中的生物正交反应的其他实例，还参见xiang等人,angew.chem.int.ed.2014,53,2190-2193)。
在一个说明性实施方案中，检测邻近于样品中的第二靶标定位的第一靶标的方法包括用包含可切割桥组分的第一缀合物标记第一靶标，所述可切割桥组分包含切割位点、可检测部分和第一化学连接基团，用包含不可切割桥组分的第二缀合物标记第二靶标，所述不可切割桥组分包含第二化学连接基团，活化所述第一化学连接基团或所述第二化学连接基团，所以可以形成其中第一靶标和第二靶标邻近的共价键；从第一靶位点切割可检测部分；洗涤样品以除去未结合的可检测部分；且检测可见的可检测部分。
缀合物a和可切割桥组分
分子诸如抗体用至少一个可切割桥组分修饰。图1a和图1b显示可切割桥组分的示意性结构。可切割桥组分包含切割位点、可检测部分/半抗原和化学连接基团(cl)。切割位点被定位为比可检测部分/半抗原或化学连接基团更邻近于抗体。化学连接基团被定位于可切割桥组分的末端处或附近。
在一些实施方案中，所述抗体用至少两个可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少三个可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少四个可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少五个可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少十个(或更多个)可切割桥组分修饰。
可切割桥组分的化学连接基团(以及不可切割桥组分的化学连接基团)是生物正交的，例如惰性的，并且在生理条件下是稳定的。然而，在适当的条件(外部刺激)下，两个组分的化学连接基团容易形成共价键。
通常，在外部刺激后，可切割桥组分的化学连接基团和不可切割桥组分的化学连接基团可在少于3小时内形成共价键。在一些实施方案中，在外部刺激后，化学连接基团可在少于两小时内形成共价键。在一些实施方案中，在外部刺激后，化学连接基团可在少于一小时内形成共价键。在一些实施方案中，在外部刺激后，化学连接基团可在少于30分钟内形成共价键。
化学连接基团(cl)的非限制性实例显示于图2中。例如，化学连接基团可以包含叠氮化物(
在其他实施方案中，可以酶促引发化学连接。例如，酪酰胺或醌甲基化物前体可用作化学连接基团，其与邻近酶相互作用以形成反应性物质。反应性物质与可用的反应性部分(例如胺或硫醇基团)形成键，以在酪酰胺和可用的反应性基团之间形成共价键。
可切割桥组分的切割位点可以包含任何适当的切割位点。通常已知的切割位点包括但不限于二硫键、二醇、硝基苯基衍生物等。二硫键切割位点(s-s)显示于图4的示意图(上图)中。可以例如通过二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(bme)、三(2-羧乙基)膦(tcep)等或其组合来切割二硫键切割位点。二醇，特别是邻位二醇，切割位点可以例如(通过naio4)来切割。类似地，邻位羟胺也可以类似地切割。硝基苯基衍生物切割位点可以例如通过紫外光照射来切割。本发明不限于上述切割位点和切割诱导剂/催化剂。
可检测部分(例如，半抗原)可以是任何适当的小分子非内源化合物、肽标签、寡核苷酸等。图4中所示的分子的特征在于包含人流感血凝素(ha-标签)肽(ypydvpdya,seqidno:1)的可检测部分。此处，ha肽还充当支架以连接切割位点(二硫键)和化学连接基团(叠氮化物(n3))，cl-a。配偶体抗体用末端炔基作为不可切割的cl-b修饰以提供缀合物b。
其他分子可以用作可检测部分。例如，通常使用的肽半抗原包括flag标签(dykddddk,seqidno:2)、myc标签(eqkliseedl,seqidno:3)、v5标签(gkpipnpllgldst,seqidno:4)、e-标签(gapvpypdplepr,seqidno:5)和vsv标签(ytdiemnrlgk,seqidno:6)。
不希望将本发明限于任何理论或机制，肽可以用作可检测部分/半抗原，因为它们是市售的并且还可以充当三官能分子中的支架。图5显示用赖氨酸作为支架的可切割桥组分(三官能分子)的另一个实例。
图7显示包含抗体和可切割桥组分的缀合物(缀合物a)的合成。将spdp-dpeg8-nhs酯(quantabiodesign,ltd.,plaincity,oh)(参见式(iii))与山羊抗兔抗体缀合。
例如，使用20-30当量的spdp-peg8-nhs酯，并将反应物在室温下保持至少2小时，并使用zeba旋转柱(thermofisherscientificinc.,rockford,il)纯化修饰的抗体，并用pbs(ph=7.2))洗脱。然后用~10当量的肽cys-ha-n3(bio-synthesisinc,lewisville,tx)(参见式(iv))(其包含血凝素(ha)可检测部分和叠氮化物化学连接基团)处理修饰的抗体，并在室温下孵育过夜。
通过使用superdex20010/300gl柱在akta纯化仪(gehealthcarebio-sciences,pittsburgh,pa)上的大小排阻色谱法纯化最终缀合物gar-peg8-ss-ha-n3(缀合物a)并用pbs(0.1m,ph=7.2)洗脱。典型的色谱图显示于图8中。洗脱结束时的峰表明作为与spdp标记的抗体的cys-肽缀合的结果存在2-吡啶硫酮(e343nm~8000cm-1m-1)。图7的该缀合物a包含二硫化物可切割键、ha-标签可检测部分和叠氮化物化学连接基团。
存在各种构建修饰的特异性结合分子(缀合物a、b)的方法，并且本发明不限于本文所述的那些。在一些实施方案中，在肽与抗体缀合后形成可切割接头(切割位点)(参见图7，其中肽与spdp修饰的抗体缀合)。或者，可以用已经含有所有三种官能团(可切割接头/切割位点、化学连接基团、可检测部分)的分子直接修饰抗体(例如参见图5)。本领域普通技术人员可以使用替代合成机制，其中在各个或同时阶段将官能团添加至分子。
缀合物b和不可切割桥组分
分子诸如抗体用不可切割桥组分修饰。图1c显示不可切割桥组分(三官能分子)的示意性结构。不可切割桥组分在其末端处或附近包含化学连接基团(cl)。
在一些实施方案中，所述抗体用至少两个不可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少三个不可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少四个不可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少五个不可切割桥组分修饰。在一些实施方案中，所述抗体用至少十个(或更多个)不可切割桥组分修饰。
如前所讨论，不可切割桥组分的化学连接基团(以及可切割桥组分的化学连接基团)是生物正交的，例如惰性的，并且在生理条件下是稳定的。然而，在适当的条件(外部刺激)下，两个桥组分的化学连接基团容易形成共价键。
如前所讨论，化学连接基团(cl)的非限制性实例显示于图2中。例如，化学连接基团可以包含叠氮化物(
本文描述了缀合物b(包含抗体和不可切割桥组分)的合成的非限制性实例：pbs中的山羊抗小鼠(gam)或山羊抗兔(gar)用15至30当量的炔-peg4-nhs酯(clickchemistrytools,scottsdale,az)(参见式(v))处理，并在室温下孵育至少2小时。
使用zeba旋转柱纯化修饰的抗体，在pbs(0.1m,ph=7.2)中洗脱，以提供gam-peg4-cch或gar-peg4-cch。
如前所讨论，可以提供任何适当的外部刺激以实现缀合物的化学连接基团之间的共价键。例如，在一些实施方案中，图4中显示的缀合物用铜(i)处理，所述铜(i)催化炔烃的huisgen1,3-偶极环加成为叠氮化物以形成1,4-二取代的-1,2,3-三唑。在一些实施方案中，在涉及cu(i)的反应中使用配体。一个实例是三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta)(sigma-aldrich或clickchemistrytools)(参见式(vi))。
本发明的抗体被选择为不彼此结合或彼此聚集，以便防止背景信号。
不希望将本发明限于任何理论或机制，可切割接头的设计允许分离测定的两个主要步骤：化学连接基团在生理条件下是稳定的并且仅在适当的外部刺激后与不可切割接头的配偶体化学连接基团反应。并且，切割位点允许在随后和分开的步骤期间切割可切割接头。
可检测部分
尽管不是详尽的，但wo2012024185(其以其整体通过引用并入本文)提供了关于目前可用的色原和半抗原的公开内容。可检测标记的实施方案包括半抗原，诸如吡唑类，特别是硝基吡唑类；硝基苯基化合物；苯并呋咱类；三萜类；脲类和硫脲类，特别是苯基脲类，甚至更特别是苯基硫脲类；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物，本文也称为鱼藤酮类；噁唑和噻唑类，特别是噁唑和噻唑磺酰胺类；香豆素和香豆素衍生物；环木脂体类，例如鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物；及其组合。半抗原及其制备和使用方法的实施方案公开于美国专利号7,695,929，其以其整体通过引用并入本文。
示例性的半抗原包括但不限于bd(苯并二氮杂䓬)、bf(苯并呋咱)、dabsyl(4-(二甲基氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺)、dcc(7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸)、dig(洋地黄毒苷)、dnp(二硝基苯基)、hq(3-羟基-2-喹喔啉甲酰胺)、nca(硝基肉桂酸)、np(硝基吡唑)、ppt(鬼臼毒素)、rhod(若丹明)、rot(鱼藤酮)和ts(噻唑磺酰胺)。其他合适的半抗原包括生物素和荧光素衍生物(fitc(异硫氰酸荧光素))、tamra(四甲基若丹明)、德克萨斯红等)。
合适的发色团包括香豆素和香豆素衍生物。示例性的基于香豆素的发色团包括dcc和2,3,6,7-四氢-11-氧代-1h,5h,11h-[1]苯并吡喃并[6,7,8-ij]喹嗪-10-甲酸。适合使用的另一类显色部分包括含重氮色原体，诸如具有约436nm的λmax的dabsyl和具有约427nm的λmax的酒石黄。
在还有其他实施方案中，发色团可以是三芳基甲烷化合物。示例性的三芳基甲烷发色团提供如下：
示例性的环状发色团包括但不限于：
其他若丹明衍生物，诸如四甲基若丹明类(包括tmr、tamra和反应性异硫氰酸酯衍生物)和二芳基若丹明衍生物，诸如qsy7、qsy9和qsy21染料。
其他示例性的可检测标记包括试卤灵，dab；aec；cn；bcip/nbt；快红；快蓝；洋红；nbt；alkgold；级联蓝色乙酰基叠氮化物；dapoxyl磺酸/羧酸琥珀酰亚胺酯；dy-405；alexafluor405琥珀酰亚胺酯；级联黄琥珀酰亚胺酯；吡啶并噁唑琥珀酰亚胺酯(pympo)；太平洋蓝琥珀酰亚胺酯；dy-415；7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯；dyq-425；6-fam亚磷酰胺；荧光黄；碘乙酰胺；alexafluor430琥珀酰亚胺酯；dabcyl琥珀酰亚胺酯；nbd氯化物/氟化物；qsy35琥珀酰亚胺酯；dy-485xl；cy2琥珀酰亚胺酯；dy-490；俄勒冈绿488羧酸琥珀酰亚胺酯；alexafluor488琥珀酰亚胺酯；bodipy493/503c3琥珀酰亚胺酯；dy-480xl；bodipyflc3琥珀酰亚胺酯；bodipyflc5琥珀酰亚胺酯；bodipyfl-x琥珀酰亚胺酯；dyq-505；俄勒冈绿514羧酸琥珀酰亚胺酯；dy-510xl；dy-481xl；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(joe)；dy-520xl；dy-521xl；bodipyr6gc3琥珀酰亚胺酯；赤藓红异硫氰酸酯；5-羧基-2',4',5',7'-四溴砜荧光素琥珀酰亚胺酯；alexafluor532琥珀酰亚胺酯；6-羧基-2',4,4',5'7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺酯(hex)；bodipy530/550c3琥珀酰亚胺酯；dy-530；bodipytmr-x琥珀酰亚胺酯；dy-555；dyq-1；dy-556；cy3琥珀酰亚胺酯；dy-547；dy-549；dy-550；alexafluor555琥珀酰亚胺酯；alexafluor546琥珀酰亚胺酯；dy-548；bodipy558/568c3琥珀酰亚胺酯；若丹明红-x琥珀酰亚胺酯；qsy7琥珀酰亚胺酯；bodipy564/570c3琥珀酰亚胺酯；bodipy576/589c3琥珀酰亚胺酯；羧基-γ-若丹明(rox)；琥珀酰亚胺酯；alexafluor568琥珀酰亚胺酯；dy-590；bodipy581/591c3琥珀酰亚胺酯；dy-591；bodipytr-x琥珀酰亚胺酯；alexafluor594琥珀酰亚胺酯；dy-594；羧基萘荧光素琥珀酰亚胺酯；dy-605；dy-610；alexafluor610琥珀酰亚胺酯；dy-615；bodipy630/650-x琥珀酰亚胺酯；食用色素亮蓝(erioglaucine)；alexafluor633琥珀酰亚胺酯；alexafluor635琥珀酰亚胺酯,；dy-634；dy-630；dy-631；dy-632；dy-633；dyq-2；dy-636；bodipy650/665-x琥珀酰亚胺酯；dy-635；cy5琥珀酰亚胺酯；alexafluor647琥珀酰亚胺酯；dy-647；dy-648；dy-650；dy-654；dy-652；dy-649；dy-651；dyq-660；dyq-661；alexafluor660琥珀酰亚胺酯；cy5.5琥珀酰亚胺酯；dy-677；dy-675；dy-676；dy-678；alexafluor680琥珀酰亚胺酯；dy-679；dy-680；dy-682；dy-681；dyq-3；dyq-700；alexafluor700琥珀酰亚胺酯；dy-703；dy-701；dy-704；dy-700；dy-730；dy-731；dy-732；dy-734；dy-750；cy7琥珀酰亚胺酯；dy-749；dyq-4；和cy7.5琥珀酰亚胺酯。
实施例1
实施例1描述了用于本发明测定中的抗体的非限制性实例。
试剂抗ha抗体：来自sigma-aldrich(b9183-100ug)的小鼠单克隆抗ha-生物素抗体(克隆ha-7)
邻近测定中使用的一抗：抗e-钙粘蛋白兔单克隆抗体、克隆ep700y(ventana760-4440)、抗e-钙粘蛋白小鼠单克隆抗体克隆36(ventana790-4497)、抗β-联蛋白小鼠单克隆抗体克隆14(ventana760-4242)、抗-p120联蛋白小鼠单克隆抗体克隆98(ventana790-4517)、抗her-2/neu兔单克隆抗体克隆4b5(ventana790-2991)、抗pr兔单克隆抗体克隆1e2(ventana790-2223)、抗cd21兔单克隆抗体克隆ep3093(ventana760-4438)、抗cd21小鼠单克隆抗体克隆2g9(ventana760-4245)、抗pms2兔mab克隆epr3947(ventana760-4531)、抗mlh1小鼠mab克隆m1(ventana790-4535)、抗cd19小鼠单克隆抗体克隆le-cd19(genetex,inc.irvine,ca)、抗磷酸酪氨酸小鼠mab克隆p-tyr-100和抗泛素小鼠mab克隆p4d1(cellsignalingtechnology,inc.,danvers,ma)。
实施例2
实施例2描述了使用ihc检测图7中的分子(gar-peg8-ss-ha-n3)中作为可检测部分/半抗原的ha肽的存在。通过使用抗ki-67(30-9)兔单克隆抗体(ventana790-4286)作为一抗和gar-peg8-ss-ha-n3作为二抗，随后xha-生物素、sa-hrp和dab染色，证实扁桃体组织中ki67的检测(参见图9)。实现了靶标的强烈和特异性染色，因此证实ha标签作为gar缀合物中的半抗原的存在。
实施例3
实施例3描述了用于确定从组织完全ha标签切割的条件的实验：
由于邻近测定的读出值在该具体实例中基于作为半抗原的ha标签的检测，所以从与非邻近蛋白结合的抗体完全切割ha标签的能力对于测定的整体成功是重要的。残余的未切割的ha标签可产生背景信号。这对于低表达邻近事件或当采用扩增方案时是重要的问题。根据本实施例，使用二硫化物作为可切割接头，因此使用还原剂(例如dtt或tcep)进行切割。为了确定足以实现完全切割的条件，检查了已知丰富的靶标诸如扁桃体中的ki67和皮肤中的e-钙粘蛋白的检测与酪酰胺(tyramide)-半抗原(例如hq)扩增的组合。在实现完全切割(切割后无染色)的情况下，将条件鉴定为足够的。因为缀合物结构未被修饰，所以这些条件被理解为适用于使用该特定缀合物的大多数测定法。图11显示用于确定完全切割的条件的方案。
如图12a-图12d以及图13a和图13b中所示，用用于ki-67的75mmdtt和用于e-钙粘蛋白的50mmdtt处理后，切割是完全的(dtt浓度是添加至每个载片的100μl溶液，而不是组织上的有效浓度，其通常为添加的浓度的1/3或1/4)。因此，20至25mmdtt有效浓度与24分钟孵育时间被确定为对于当前的测定形式是足够的。
实施例4
验证gam-peg4-cch中乙炔基的存在
现在参考图14，通过用生物素-peg7-n3(quantabiodesign)进行原位点击反应(clickreaction)证实gam-peg4-cch的缀合物中反应性乙炔基的存在。具体地，ffpe扁桃体切片首先用ezprep溶液(ventana)脱蜡，并用反应缓冲液洗涤。将小鼠抗cd20一抗(克隆l26,ventana760-2531)添加至该切片，并在37℃下孵育16分钟。用反应缓冲液洗涤后，添加100µl10µg/mlgam-peg4-cch，并在37℃下孵育16分钟，随后彻底洗涤。然后以两种不同配体(thpta)浓度向该切片添加100μl的1mm生物素-peg7-n3、0.6mmcuso4、20mm抗坏血酸钠。在室温下孵育32分钟后，将载片充分洗涤。通过使用sa-hrp和dab色原体实现生物素的检测。如下图中所示，仅当添加cu时才能实现cd20的特异性检测。当省略cu时，完全没有染色。结果强烈地表明在gam缀合物中存在反应性乙炔官能团。图14a-图14c是显示扁桃体切片中cd20的检测的显微照片，其显示cu(i)/l比率和伴随染色的效果。图14a显示1:5的cu(i)/比率，图14b显示1:3的cu(i)/l比率，且图14c显示不添加cu(i)的对照。使用gam-peg4-cch的缀合物中的反应性乙炔基(参见实施例3)。当添加cu(i)时，实现了cd20的特异性检测。当省略cu时，没有观察到染色。这表明在gam缀合物中存在反应性乙炔官能团。
实施例5
实施例5描述了使用本发明的方法的实验。
用于邻近测定的实验程序
除非另有说明，否则所有未明确描述为别处来源的抗体和ihc试剂都来自ventanamedicalsystems,inc.(tucson,az;“ventana”)。在ventanabenchmarkxt自动化载片处理系统(ventana)上进行ihc染色。对于所有ihc染色，ffpe切片首先用ezprep溶液(ventana)脱蜡，并用反应缓冲液洗涤。在cellconditioning1(ventana)中进行抗原修复(100℃；92分钟)，并再次用1x反应缓冲液(ventana)洗涤。将针对目标靶标的一抗应用于载片并在37℃下孵育32分钟(参见测试的抗体对的结果)。用反应缓冲液彻底洗涤后，将gar-peg8-ss-ha-n3和gam-peg4-cch的二抗缀合物(100µl，各10µg/ml)添加至载片，并在37℃下孵育32分钟。将载片在反应缓冲液和水中洗涤，然后将一滴100μlhepes缓冲液(0.15m,ph7.4)添加至载片。为了起始叠氮化物-乙炔点击反应，将100μl的cu(i)催化剂溶液添加至载片上。cu(i)溶液的一种工作实例含有0.6mmcuso4、3mmthpta、10mmhepes(ph=7.4)、40%dmso(v/v)和4mm抗坏血酸钠(新鲜制备并在临添加至载片前添加至cuso4)。使点击反应进行32分钟，并将载片在反应缓冲液中彻底洗涤。接下来，将100µl50-75mmdtt(二硫苏糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦)溶液(sigma-aldrich)添加至载片并孵育24分钟。dtt或tcep溶液的浓度取决于靶标的丰度。高表达的靶标需要更高的dtt或tcep浓度，以确保gar-peg8-ss-ha-n3中二硫键的完全切割。洗涤后，通过添加抗ha抗体探测由于邻近诱导的半抗原转移而导致的ha标签的存在。在此处所示的实施例中，使用用生物素标记的小鼠单克隆抗ha抗体(克隆ha-7)(sigma-aldrich,b9183)。将100微升2μg/ml的抗ha生物素添加至每个载片，随后洗涤并添加100μl链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(sa-hrp)缀合物(ventana)。对于使用二氨基联苯胺(dab)的基于显色的检测，使用来自ultraviewdab检测试剂盒(ventana)的dab、h2o2和铜的即用溶液，随后用苏木精ii和bluing(ventana)进行复染。或者，在添加sa-hrp后，用花菁5-酪酰胺缀合物(cy5-tyr)实现检测。使用来自perkinelmer(waltham,ma)的tsa™pluscyanine5系统试剂盒。将100微升1xplus扩增稀释液中的1:50花菁5-酪酰胺添加至每个载片并孵育16分钟。用vectashieldhardset封固介质用dapi(h-1500,vectorlaboratories,inc.burlingame,ca)封固载片。使用olympucbx3-cbh显微镜获取荧光图像。
为了增强检测，使用optiview扩增试剂盒(ventana860-099)采用酪酰胺信号扩增方案，所述扩增试剂盒使用与酪酰胺偶联的非内源性半抗原3-羟基-2-喹喔啉(hq)。在8分钟tsa反应和去除过量试剂后，添加与hrp缀合的抗hq抗体并孵育16分钟。最后，以12分钟反应使用ultraviewdab检测试剂盒(ventana)实现检测。通过标准明场显微镜检查dab染色。图10显示如上所述的ihc程序的主要步骤的流程图。
结果
e-钙粘蛋白/β-联蛋白/p120-联蛋白复合物的检测
e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)/p120-联蛋白(p120)的复合物(naturereviewsmolecularcellbiology,2005,6,622-634)提供了一种容易获取的用于表明邻近测定的模型。基于一抗的可用性，测试了三对靶标：e-cad/β-cat、e-cad/p120和e-cadms/rb一抗。还使用两种类型的阴性对照：省略一抗之一或省略cu(i)催化剂。此外，在扁桃体和皮肤组织切片上进行测定，以检查测定的通用性。结果显示于图16-图19。现在参考图16a-图16d，其显示这样的显微照片，其中显示用市售的半抗原-酪酰胺扩增(ventanaoptiview扩增试剂盒)检测正常扁桃体组织切片中的e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)。图16a显示省略小鼠抗β-cat的测定，图16b显示省略兔抗e-cad的测定，图16c显示用cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat邻近测定，且图16d显示排除cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat邻近测定。
现在参考图17a-图17d，其显示这样的显微照片，其中图17a显示用于使用cu(i)和ventanaoptiviewdab以及ventana扩增试剂盒测定正常扁桃体切片载片中的e-钙粘蛋白(e-cad)和p120-联蛋白(p120)的邻近的测定，且图17b显示不包括cu(i)的阴性对照。图17c-图17d是切片的显微照片，其中用如本文所述的邻近测定(图17c)和排除cu(i)的邻近测定(图17d)使用结合正常扁桃体组织切片中的蛋白的不同表位的小鼠抗ecad和兔抗ecad一抗检测e-钙粘蛋白。参考图18a-图18d，其显示这样的显微照片，其中显示用扩增检测用ventanaoptiviewdab染色的正常皮肤组织切片中的e-钙粘蛋白(e-cad)/β-联蛋白(β-cat)。图18a显示e-cad和β-cat之间的邻近测定，且图18b是其中排除cu(i)的对照。图18c还显示不同皮肤切片中的e-cad和β-cat之间的邻近测定，且图18d是其中排除cu(i)催化剂的相应阴性对照。
图19a-图19c是显示使用cy5-tyr的正常扁桃体切片中的ecad/β-cat的基于荧光团-酪酰胺的检测的显微照片(蓝色=dapi，红色=用于ecad/β-cat的cy5)。
在所有测定中，只有当存在所有必需组分(一抗和cu(i)催化剂两者)时，才实现阳性染色。如果省略一抗之一或cu(i)催化剂，则不能获得阳性染色。这些结果清楚地表明该测定对于ffpe组织的可行性和特异性。此外，可以通过显色或荧光信号来实现检测，这表明方法的灵活性。
cd19/cd21复合物的检测
为了进一步表明该方法的通用性，进行扁桃体中的cd19/cd21复合物的检测。cd19是从前b细胞至浆细胞阶段表达的b细胞特异性跨膜糖蛋白。在成熟b细胞上，cd19与三种不同的分子缔合以形成包含cd21(补体受体2型)、cd81(抗原加工转运蛋白1)和leu13(干扰素诱导的跨膜蛋白1)的四聚体复合物(naturereviewsimmunology2,354-363,2002)。结果显示于图20a-图20d中，其为图20a中显示用扩增的用ventanaoptiviewdab染色的正常扁桃体组织切片中的cd19/cd21的邻近测定的显微照片。图20b是图20a的对照，其中排除cu(i)。图20c显示在正常扁桃体组织中通过使用小鼠抗cd21和兔抗cd21一抗检测cd21，且图20d是图20c的对照，其中排除cu(i)。再次，仅当应用所有必需的抗体和cu(i)催化剂时才能实现特异性染色。
实施例6
实施例6描述了使用本发明的方法的实验。本发明可用于检测各种翻译后修饰状态，诸如磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和/或等。实施例4描述了使用本发明的方法以检测蛋白磷酸化和泛素化的实验。
her2磷酸化的检测结果是calu3异种移植物，其显示于图21a-图21c中。仅当应用抗her2和抗酪氨酸磷酸化抗体(p-tyr)时才检测到信号，并且当省略抗p-tyr或cu(i)催化剂时则检测不到信号。
不希望将本发明限于任何理论或机制，据信不可能产生特异性抗体以检测具有泛素修饰的特异性蛋白。与其中具有磷酸化氨基酸残基的肽可以容易地用作免疫原以产生抗体的磷酸化蛋白的检测不同，泛素是8.5kda蛋白，因此使得非常难以产生特异性泛素化蛋白的抗体。然而，针对泛素本身的抗体广泛可用(例如通过使用全长泛素作为免疫原产生)，其可以与针对特定目标蛋白的抗体配对，以提供用于使用本发明中的邻近测定方法检测泛素化蛋白的方法。
图22-图27涉及用于检测泛素化蛋白(例如pr、her2)的测定法。如图22中所示，对蛋白本身特异性的抗体与对泛素特异性的抗体组合使用。如果两个靶标非常邻近(例如蛋白被泛素化)，则可以形成桥组分之间的共价键(在外部刺激(例如催化剂等)后)。然后可以从一抗切割桥组分，并且随后可以使用检测系统(例如，显色检测系统)检测共价键合的桥组分。对于图23-图26中的测定，使用小鼠抗泛素(克隆p4d1)mab作为泛抗泛素抗体(cellsignalingtechnology)，且使用兔抗pr(克隆1e2，ventana目录号790-2223)作为抗pr抗体。
如图23-图26中所示，仅应用所有必需的抗体和cu(i)才检测到阳性信号。有趣的是，信号似乎是异质的，这表明当前的原位邻近测定法相对于“研磨和结合”方法(诸如western印迹)(其中会丢失异质性信息)的独特优势。此外，在每个细胞中没有观察到阳性染色，这表明目前方法的极高的距离严格性，因为pr和泛素的核共定位(如标准ihc中所示)不足以产生邻近信号。此外，染色均位于细胞核中，这与靶标的天然表达模式一致。对于图27中的测定，使用兔抗her2(克隆4b5，ventana目录号790-2991)作为抗her2抗体。并且仅在calu3异种移植物中观察到阳性信号，其中her2表达是阳性的。
实施例7
实施例7描述使用本发明的邻近测定法检测mlh1-pms2异源二聚体。图28a显示使用兔抗pms2mab(克隆epr3947，ventana760-4531)的hela细胞异种移植物中pms2的ihc的结果。预期的核染色是可见的。图28b显示使用兔抗mlh1mab(克隆m1，ventana790-4535)的hela细胞异种移植物中mlh1的ihc的结果。证实预期的核染色。图28c显示使用添加cu(i)催化剂的当前方法的mlh1-pms2异源二聚体的邻近测定的结果。注意信号的核定位和异质性。图28d显示使用当前方法、但没有添加cu(i)催化剂的mlh1-pms2异源二聚体的邻近测定的结果。结果进一步表明了本发明的特异性和通用性。
如本文所用，术语“约”是指±所提及数字的10％。除了本文描述的那些改变以外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言，从前面的描述是显而易见的。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围之内。本申请中引用的每个参考文献都以其整体通过引用并入本文。
尽管已经显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对其进行修改，其不超出所附权利要求的范围。因此，本发明的范围仅由所附权利要求限制。权利要求中记载的参考标记是示例性的，并且仅为了易于由专利局审查，并且不以任何方式限制。在一些实施方案中，本专利申请中给出的附图按比例绘制，包括角度、尺寸比等。在一些实施方案中，附图仅是代表性的，并且权利要求不受附图的尺寸所限制。在一些实施方案中，本文使用短语“包含”描述的本发明的描述包括可以被描述为“由...组成”的实施方案，并且因此符合用于使用短语“由...组成”来请求保护本发明的一个或多个实施方案的书面描述要求。
在下面权利要求中列举的参考标记仅用于容易地审查本专利申请，并且是示例性的，并且不意欲以任何方式将权利要求的范围限制为具有附图中相应参考标记的特定特征。
序列表
<110>ventanamedicalsystems,inc.
<120>使用化学连接和半抗原转移的邻近测定法
<130>p32348-wo
<150>us62/084452
<151>2014-11-25
<150>us62/116962
<151>2015-02-17
<160>6
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>1
tyrprotyraspvalproasptyrala
15
<210>2
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>2
asptyrlysaspaspaspasplys
15
<210>3
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>3
gluglnlysleuileserglugluaspleu
1510
<210>4
<211>14
<212>prt
<213>智人
<400>4
glylysproileproasnproleuleuglyleuaspserthr
1510
<210>5
<211>13
<212>prt
<213>智人
<400>5
glyalaprovalprotyrproaspproleugluproarg
1510
<210>6
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>6
tyrthraspileglumetasnargleuglylys
1510
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