技术领域本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法，具体是基于分子印迹特异性识别作用，用于检测药品、生物样品中的六甲蜜胺技术。
背景技术：
六甲蜜胺(HMM)是一种新的抗癌药，具有广谱抗癌活性。化学结构与烷化剂三乙撑蜜胺(TEM)相以。其不同点在于以二个甲基团代替TEM分中的乙烯基。但作用方式不同，其作用为一种嘧啶类抗代谢药物，抑制二氢叶酸还原酶，抑制胸腺嘧啶和尿嘧啶参入DNA和RNA。为S期周期特异性药物，与顺铂和烷化剂无交叉耐药。本品对多种动物肿瘤均有明显抑制作用，重复性强。近年来的临床研究发现，其对卵巢癌、肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤有肯定的疗效，特别是在对晚期卵巢癌的研究中，由于其毒副作用小并与烷化剂等抗肿瘤药物之间无交叉抗药性等特点，故可与其他化疗药物合用提高疗效，因而具有较好的临床应用价值。六甲蜜胺及其胶囊在《中国药典》2005年版及美国药典版均有收载，含量测定方法分别为非水滴定法和高效液相色谱法。根据中国药典2010年版修订的指导原则，考虑制剂中的辅料对非水滴定方法的准确度和灵敏性具有一定的影响，建立了专属性强的高效液相色谱法测定六甲蜜胺胶囊的含量，该方法亦能较好地分离六甲蜜胺原料中的杂质，经试验，该方法快速、准确、灵敏。但高效液相色谱法所使用的仪器昂贵，实验过程中耗材价格高，需要十分专业的技术人员操作，测定的周期也比较长，高效液相色谱法普及率不高。因此，建立一种选择性好、灵敏度高、操作简便、费用低的检测方法，用于检测六甲蜜胺的含量具有十分重要的意义。分子印迹技术是制备具有特定选择性和亲和能力的分子识别材料的新兴技术，并以其预定性、特异识别性和广泛实用性三大显著特点在色谱分离、固相萃取、仿生传感、膜分离等诸多领域显示出良好的发展与应用前景。当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注。依据此技术制备的分子印迹电化学传感器，应用于药物分析、生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高而且再生和可逆性差，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、政府管理部门等的迫切需要的，对药品、生物样品中的六甲蜜胺含量准确定量测定十分必要，对于六甲蜜胺生产和药理研究也具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法，主要是以六甲蜜胺为模板，在玻碳电极表面通过γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷、纳米金粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制备六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。仪器与试剂CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极（SCE），玻碳电极（GCE）为工作电极；KQ-250E型超声波清洗器；甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷，无水乙醇，二丙烯酸乙二醇酯，氯丙稀，松香，马来酸酐，偶氮二异丁酸二甲酯，六甲蜜胺；氯金酸，柠檬酸钠，磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。本发明的目的通过如下技术方案实现。一种六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于,该方法具有以下工艺步骤：（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为35~40%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡100~120min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡4~6h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20~25%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：56~66%，松香：5~10%，马来酸酐：5~10%，二丙烯酸乙二醇酯：8~14%，氯丙烯：8~14%，偶氮二异丁酸二甲酯：0.5~2.0%，六甲蜜胺：1.5~3.0%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应10~12h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶4~6μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡6~8h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。步骤（3）中所述的惰性气体氛围为通惰性气体一直通入直到反应结束。步骤（3）中所述的惰性气体为氖气或氩气。步骤（3）中所述的松香与马来酸酐的质量比为1：1。步骤（4）中所述的乙醇与盐酸混合溶液的体积比为20：1。本发明的优点及效果是：本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，玻碳电极通过硅烷偶联剂连接将纳米金修饰在电极表面，使其提高导电性能，再在纳米金的基础上滴涂分子印迹聚合物，成功地研制了一种具有特异选择性的印迹电化学传感器。通过与无纳米金修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的响应信号大大提高。该印迹传感器对六甲蜜胺表现出较高的亲和性、灵敏性和选择性，响应电流与六甲蜜胺的浓度在1.2×10-8~8.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.06×10-8mol/L将本发明制备的六甲蜜胺分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中六甲蜜胺的检测中，回收率在96.26~104.32%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药检测等相关领域。具体实施方式实施例1（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为38%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为22%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：77mL，松香：8g，马来酸酐：8g，二丙烯酸乙二醇酯：9.5mL，氯丙烯：12mL，偶氮二异丁酸二甲酯：1.0g，六甲蜜胺：2.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应11h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶5μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡7h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。实施例2（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为35%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡120min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡4h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为20%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：42mL，松香：3g，马来酸酐：3g，二丙烯酸乙二醇酯：6mL，氯丙烯：4.2mL，偶氮二异丁酸二甲酯：0.25g，六甲蜜胺：0.75g，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应12h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶4μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡6h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。实施例3（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为40%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡100min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡6h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为25%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：36mL，松香：5g，马来酸酐：5g，二丙烯酸乙二醇酯：4mL，氯丙烯：6.5mL，偶氮二异丁酸二甲酯：0.75g，六甲蜜胺：1.5g，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应12h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶6μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡8h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。实施例4（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为36%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡4.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为24%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：74mL，松香：5g，马来酸酐：5g，二丙烯酸乙二醇酯：13.3mL，氯丙烯：15mL，偶氮二异丁酸二甲酯：2.0g，六甲蜜胺：2.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应10.5h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶5μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡6.5h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。实施例5（1）玻碳电极预处理：将玻碳电极0.01~0.05μm的Cr2O3粉末进行表面抛光，然后用二次蒸馏水超声清洗，再用无水乙醇洗涤数次，用氮气吹干，将电极浸泡在含质量百分浓度为39%的甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中，温度升至60±2℃浸泡110min，取出后，用无水乙醇洗涤数次，干燥，得到预处理玻碳电极；（2）纳米金修饰玻碳电极的制备：将预处理玻碳电极放入0.25mol/L氯金酸水溶液中，室温下浸泡5.5h，取出后用去离子水洗涤，再放入质量百分浓度为23%的柠檬酸钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水洗涤，自然干燥，即得纳米金修饰玻碳电极；（3）六甲蜜胺分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：42mL，松香：3.5g，马来酸酐：3.5g，二丙烯酸乙二醇酯：5.2mL，氯丙烯：4.7mL，偶氮二异丁酸二甲酯：0.75g，六甲蜜胺：0.75g，搅拌溶解，通惰性气体除氧5min，惰性气体氛围，温度升至75±2℃搅拌反应11.5h，即得六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶；（4）六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法：取六甲蜜胺分子印迹聚合物溶胶6μL滴加到纳米金修饰玻碳电极上，置于红外灯下，挥发干溶剂后，将其用乙醇与盐酸的混合溶液浸泡7.5h，除去电极上的模板分子，用去离子水洗涤，自然干燥，即得六甲蜜胺分子印迹电化学传感器。实施例6将上述实施例1~5所制备的六甲蜜胺分子印迹电化学传感器，用于六甲蜜胺的检测，步骤如下：（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的六甲蜜胺（溶于乙醇）标准溶液，底液为pH6.8的磷酸盐缓冲溶液；（2）工作曲线绘制：将Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明所述一种六甲蜜胺分子印迹电化学传感器的制备方法所制备的六甲蜜胺分子印迹电化学传感器为工作电极组成三电极系统，连接CHI660B电化学工作站，在K3[Fe(CN)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.10~0.9V电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为I0，含有不同浓度的六甲蜜胺标准溶液的响应电流即为Ii，响应电流降低的差值为△I=I0-Ii，△I与六甲蜜胺标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△I~c工作曲线；（3）六甲蜜胺的检测：用待测样品代替步骤（1）中的六甲蜜胺标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△I和工作曲线，得到待测样品中六甲蜜胺的含量；所述K3[Fe(CN)6]溶液的浓度为4.0mmol/L；所述pH6.8的磷酸盐缓冲溶液的浓度在80mmol/L。响应电流与六甲蜜胺的浓度在1.2×10-8~8.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为1.06×10-8mol/L将本发明制备的六甲蜜胺分子印迹电化学传感器成功用于药品、生物样品中六甲蜜胺的检测中，回收率在96.26~104.32%之间，因此本发明制备的分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药检测等相关领域。