多种转基因元件同时快速检测的方法与流程

本发明属于荧光共振能量转移领域，特指多种转基因元件同时快速检测的方法，具体为荧光共振能量转移传感器的制备及对转基因中启动子和终止子的快速检测方法。

背景技术：

转基因作物(Genetically Modified Organisms，简称GMOs)是指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的基因插入植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物，所引入的外源基因一般包括启动子，目的基因，终止子。目前转基因检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，聚合酶链式反应(PCR)法等。但是基于蛋白的检测方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于RAN的检测收到RNA容易降解和对实验条件要求较高的限制，从而较难普及。而尽管PCR方法是高灵敏度的DNA水平检测方法，但是常伴有各种假性结果出现：一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR样品需要量大，操作繁琐，检测时间长，还容易造成定量不准确等一系列问题。因此，发展一种非PCR扩增的快速检测方法成为GMO检测所追求的目标。

石墨烯纳米带(Graphene Nanoribbons,GNRs)是最近被发现的又一种新型碳质纳米材料，其结构介于一维碳纳米管和二维石墨烯纳米片之间，被认为是拉长的石墨带，具有准一维蜂窝构型单层带状结构，以及优异的性能，如导电性较好、材料容易制备、表面含有大量的含氧官能团而容易功能化等，研究者们已初步将其应用于电子学、光学、磁学、生物医学、催化、传感器等诸多领域。石墨烯材料自身具有荧光性能，能够通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)来有效猝灭其他分子的荧光，传统的荧光能量转移速率由供体与受体距离(d)的负6次方决定，而石墨烯材料与荧光分子的荧光能量转移速率取决于d的负4次方，荧光淬灭效率更高。但是，石墨烯纳米片之间由于存在强烈的相互作用，易于重新堆砌成石墨，这给石墨烯的应用研究造成严重的障碍。通过选择合适的功能材料与其杂化，形成石墨烯杂化材料，不仅可以有效地阻止石墨烯纳米片的重新聚集，而且所制备的石墨烯杂化材料还可能会被赋予更加优异的物理化学性能^[153]。最近的研究发现，通过将碳纳米管与石墨烯进行复合，所得到的MWCNTs/GONRs，不仅可以保持碳纳米管良好的机械性能，而且可以有效增加石墨烯纳米片的层间距使其不易团聚，具有良好的分散性。

量子点是一种新型荧光纳米材料，相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄而且不拖尾，因而，以量子点为给体的荧光共振能量转移，可减少给体与受体发射光谱的重叠；量子点的激发光谱范围较宽，当它作为能量给体时，可以更自由地选择激发波长，从而最大限度地避免对受体的直接激发；量子点的发射光谱可调，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量给体。所以，量子点应用于荧光共振能量转移的研究，已受到广大科研工作者的广泛关注。由于具有良好的化学惰性、生物相容性和较低的生物毒性，在生物成像、疾病检测、药物输送和光电器件应用领域中引起了极大关注。而碲化镉量子点(CdTe QDs)可通过控制反应时间，得到不同的荧光颜色，可实现单一检测溶液中多种目标物的同时检测。

绿色CdTeQDs(记作：gQDs)和红色CdTeQDs(记作：rQDs)同时作为FRET中的能量供体，而MWCNTs/GONRs作为FRET传感器的受体。终止子的探针(记作：NP)和启动子的探针(记作：PP)末端修饰氨基，分别与gQDs)和rQDs的羧基通过酰胺反应，形成NP-gQDs和PP-rQDs；然后两者与MWCNTs/GONRs通过π-π叠加作用，使NP-gQDs和PP-rQDs吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭QDs的荧光；当加入待检测目标DNA,即终止子NOS和启动子P35s后，目标DNA和NP-gQDs和PP-rQDs杂交互补配对，形成QDs-dsDNA,从而把NP-gQDs和PP-rQDs从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使QDs的荧光恢复。

技术实现要素：

本发明旨在发明一种多元、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的FRET方法，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的检测含有启动子P35s和终止子NOS的转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、检测目标单一的难题。

多元转基因元件检测的荧光共振能量转移传感器的制备方法：发出荧光信号的QDs通过酰胺反应和捕获探针结合，形成QDs-探针；通过探针与MWCNTs/GONRs的π-π叠加作用，使QDs-探针吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭QDs的荧光；当加入待检测目标DNA，即终止子NOS和启动子P35s后，终止子NOS和启动子P35s分别和捕获探针杂交互补配对，形成QDs-双链DNA,从而把QDs-探针从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使QDs的荧光恢复。通过所恢复的荧光强度的测定，检测转基因大豆中是否含有终止子NOS和启动子P35s以区分转基因和非转基因大豆。

本发明是通过如下技术方案实现的：

多种转基因元件同时快速检测的方法，包括如下步骤：

步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；

步骤2、绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液的制备；

步骤3、碲化镉量子点-捕获探针分散液的制备：

取步骤2制备的绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液超声分散，采用HCl调节绿色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液A；采用HCl调节红色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液B；向混合液A中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入终止子的探针(NP)，在室温下反应，得到绿色碲化镉量子点-捕获探针，记作NP-gQDs；向混合液B中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入启动子的探针(PP)；在室温下反应，得到红色碲化镉量子点-捕获探针，记作PP-rQDs；之后用乙醇洗涤，离心，最后将NP-gQDs和PP-rQDs分别分散于Tris-HCl缓冲液中，分别得到NP-gQDs分散液和PP-rQDs分散液，备用；

步骤4、荧光共振能量转移传感体系的构建：

将MWCNTs/GONRs分散液与NP-gQDs溶液和PP-rQDs溶液混合，超声分散，得到混合液，静置后，测定其荧光强度；

步骤5、标准曲线的构建：

将不同浓度的终止子NOS溶液和启动子P35s溶液加入到步骤4所得的混合液中，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；

步骤6、基于荧光共振能量转移传感体系对转基因大豆的检测：

采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA溶液，之后将转基因大豆的DNA加入到步骤4构建的荧光共振能量转移传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有NOS和P35s的结论。

步骤3中，制备NP-gQDs时，所使用的绿色碲化镉量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与捕获探针储备液的体积比为42:2:2:1；制备PP-rQDs时，所使用的红色碲化镉量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与捕获探针储备液的体积比为42:2:2:1；制备NP-gQDs和PP-rQDs时，所使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的浓度为400mM，所使用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液的浓度为200mM，所使用的捕获探针储备液的浓度为100μM；所使用的HCl浓度为10M，所调至的pH值为5，所述的在室温下反应的时间为40min；所使用的Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM，pH＝7.4，所使用的Tris-HCl缓冲溶液与所使用的绿色碲化镉量子点溶液的体积比为47:42，所使用的Tris-HCl缓冲溶液与所使用的红色碲化镉量子点溶液的体积比为47:42。

步骤4中，所使用的MWCNTs/GONRs分散液的浓度为1.5mg/mL，MWCNTs/GONRs分散液、NP-gQDs分散液和PP-gQDs分散液的体积比为1:750:750。

步骤5中，所使用终止子NOS溶液和启动子P35s溶液与步骤4中的MWCNTs/GONRs分散液体积比为15:15:4，终止子NOS溶液和启动子P35s溶液的浓度均为0～1000nM；所述超声时间为5min，静置时间为5min。

步骤6中，所使用转基因大豆所提取的DNA溶液与与步骤4中的MWCNTs/GONRs-QDs-探针分散液体积比为5:1。

所用的DNA序列如下：

启动子P35s:GGCAGAGGCATCTTCAACGATGGCC，

终止子NOS:GATTAGAGTCCCGCAATTATACATT，

启动子的探针(PP):H₂N-GGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCC，

终止子的探针(NP):H₂N-AATGATTAATTGCGGGACTCTAATC。

所述的标准曲线是指传感器与不同浓度的终止子和启动子作用，通过杂交互补配对原则，目标DNA和捕获探针结合，从而使QDs-探针从MWCNTs/GONRs表面脱离，从而发生荧光恢复。根据各个浓度所恢复的荧光绘制的标准曲线。

有益效果：

本发明基于DNA杂交互补配对的原则，使FRET传感器的荧光得以恢复，所建立的检测终止子和启动子的方法，为转基因作物中多元外源基因的同时检测提供了一种新的方法途径。该方法较转基因检测方法，具有如下优点：

(1)该传感器的制备是基于DNA互补配对杂交特异性作用所构建的，因而相对于免疫反应而言有与目标分子结合力强、特异性高、长时间暴露不容易变性、对周围环境要求不高等特点。

(2)传感器构建的设计思路清晰，采用QDs为能量供体，MWCNTs/GONRs为能量受体构建了荧光共振能量转移传感器。

(3)该方法所有试剂具有无毒，低价，合成方法简单等优点，相对于其他方法成本降低很多。

(4)该方法具有FRET传感器所具有的操作简便灵活、分析速度快、可实现多元目标的同时检测的特点，适用于多元目标的快速检测分析。

附图说明

图1为检测不同浓度终止子和启动子的标准曲线图，其中浓度自下而上依次为0,1.5,2.5,5,7.5,10,20,50,100,200,500,1000nM。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：

(1)MWCNTs/GONRs的制备

MWCNTs/GONRs采用氧化剪切多壁碳纳米管制得，具体过程如下：称取120mg多壁碳纳米管加入圆底烧瓶中，向烧瓶中加入40mL H₂SO₄/H₃PO₄(9:1)并搅拌，然后向上述混合溶液中加入600mg KMnO4，并在65℃油浴下继续搅拌2h。将反应后溶液冷却至室温，将其倒入400mL含0.375％H₂O₂的冰水中，溶液经PTFE膜(孔径0.2μm)过滤得到固体产物MWCNTs/GONRs，并继续水洗数次。

(2)碲化镉QDs的制备

将0.0673g硼氢化钠和0.0957g碲粉加入10mL比色管中，加入4mL二次水，通氮除氧15min，于4℃冰箱内反应得到上清液呈紫色透明的硼氢化钠溶液；在100mL三颈烧瓶中，加入50mL二次水，0.1142g氯化铬和75μL巯基丙酸，在搅拌条件下通氮保护，加入氢氧化钠调节溶液pH至8.5；迅速加入2mL上述新鲜制备的碲氢化钠溶液，充分搅拌后，100℃下分别回流0.5h和10h得到巯基丙酸修饰的绿色和红色碲化镉量子点；纯化步骤后，将其重新分散在10mL二次水中，置于4℃冰箱中保存备用。

(3)QDs-探针分散液的制备

取420μL QDs溶液超声分散15分钟后，加入20μL 400mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，振荡2分钟后，加入20μL 200mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续振荡20分钟。加入10μL 100μM捕获探针在室温下反应40分钟，得到QDs-探针之后用乙醇洗涤离心，最后分散于470μL的10mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中，得到QDs-探针分散液。

(4)MWCNTs/GONRs和QDs-探针FRET传感器的构建

将4μL 1.5mg/mL的MWCNTs/GONRs加入到含有3.0mL NP-gQDs分散液和3.0mL PP-gQDs分散液的混合液中，超声5min，静置5min后，测定荧光强度。

实施例2：该FRET传感器对目标DNA标准曲线的构建

将4μL 1.5mg/mL的MWCNTs/GONRs加入到含有3.0mL NP-gQDs分散液和3.0mL PP-gQDs分散液的混合液中，超声5min，静置5min后，测定荧光强度，随后加入15μL不同浓度的终止子和15μL不同浓度的启动子，超声5min后，静置40min测量其荧光恢复程度，构建标准曲线。

图1中显示，当加入NP-gQDs和PP-gQDs和MWCNTs/GONRs时，绿色碲化镉量子点和红色碲化镉量子点的荧光均被淬灭，而加入不同浓度的目标NOS终止子和P35s启动子后，随着目标物浓度的增大，两种量子点的荧光得到不同程度的恢复。根据荧光恢复程度可同时定量检测两种目标DNA。

实施例3：

基于MWCNTs/GONRs-QDs-探针构建的FRET传感器对转基因大豆中启动子和终止子的检测：

采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA。之后将20μL转基因大豆的DNA加入到MWCNTs/GONRs和NP-gQDs和PP-gQDs的FRET传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有终止子和启动子的结论，如存在，则可进一步得出终止子和启动子浓度。

FRET为荧光共振能量转移。

本发明中所用的DNA序列如下：

启动子P35s:GGCAGAGGCATCTTCAACGATGGCC，

终止子NOS:GATTAGAGTCCCGCAATTATACATT，

启动子的探针(PP):H₂N-GGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCC，

终止子的探针(NP):H₂N-AATGATTAATTGCGGGACTCTAATC。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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