一种四季三黄片的含量测定方法与流程

本发明涉及一种四季三黄片的含量测定方法，属于中药制剂含量测定技术领域。

背景技术：

口舌生疮是口腔和舌头溃烂、出现局部疼痛的口腔病，常反复发作，溃疡久不愈合。古代文献中，口舌生疮又称为口破、口疳、口疡，发生在舌的称舌疡。口舌生疮多由心脾积热、外感热邪，或脾胃湿热、阴虚阳亢所致。疮疡皆属于火，但有实火与虚火的区别，如因烟酒不节，或多食肥甘厚味、留滞生热，或外感风热、湿热之邪、入里化火，或情志郁结、久而化火、多属实火；素体阴虚，热病伤阴，或睡眠不足，长期疲劳而致人身体衰弱。

人上火之后临床症状表现为：目赤肿痛，口鼻生疮，咽喉肿痛，急性胃肠炎，痢疾等，容易在体内积累毒素，服用抗菌药后症状减轻，但副作用较大，且易复发。本病的主要症状是口腔粘膜反复出现圆形或椭圆形小溃疡，可单发或多发在口腔粘膜的任何部分，有剧烈的自发痛，一般在10天左右可自愈。发现本病时多在溃疡期，溃疡直径2-3毫米，底浅，边缘整齐，周围有红晕，溃疡面黄白色纤维素性渗出物覆盖，有剧烈的烧灼样痛，遇冷、热、酸、咸等刺激都使疼痛加重，语言、饮食均感困难，持续4-5天后转入愈合期，愈合不留任何疤痕，但可以反复发作。

四季三黄片是中新药业天津乐仁堂制药厂生产的药品，具有消炎退热，通便利水的作用。用于口鼻生疮，咽疼齿痛，口干舌燥，目眩头晕，大便秘结，小便赤黄。

四季三黄片由大黄、黄芩、栀子及黄柏四味中药组成，现标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第二十册，标准编号：WS3-B-3795-98。现行标准起草时间较早，无含量测定及鉴别等控制指标。因此参照《中国药典》2010年版一部以及“四季三黄软胶囊”、“四季三黄胶囊”等同类品种的质量标准，对四季三黄片进行薄层鉴别及含量测定方法研究，并对分析方法进行验证。

技术实现要素：

本发明公开了一种四季三黄片的含量测定方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%（w/w）磷酸的体积比79：21为流动相；检测波长为254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于12000；

（2）对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含大黄素16μg、大黄酚16μg的混合溶液，即得；

（3）供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加12%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，确定四季三黄片中每片含大黄以大黄素（C₁₅H₁₀O₅）和大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）总量计，不得少于0.70mg。

本发明更加详细的方法如下：

前处理方法的确定

1、提取条件的考察

参考《中国药典》2010年版一部中“大黄”含量测定项下大黄素和大黄酚的提取方法，采用甲醇提取，酸解，再用三氯甲烷提取等步骤进行。本试验采用相同的提取方法进行。对提取方法、提取时间、水解酸浓度及酸水解时间的进行了考察，结果如下：

1.1提取方法的考察

取本品（批号为ZL02）适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，采用加热回流与超声处理两种提取方式，时间均为1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟,再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定大黄素、大黄酚总量，结果见表1。

表1 四季三黄片提取方法考察试验结果

结果表明：甲醇回流处理的提取率较超声高，故选择甲醇回流提取方法。

1.2提取时间的考察：

取本品（批号为ZL02）适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，分别加热回流40、60、80分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟,再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定大黄素、大黄酚总量，结果见表2。

表2 四季三黄片提取时间考察试验结果

结果表明：甲醇回流60分钟即可提取完全，且随时间延长，含量反而降低，故选择甲醇回流60分钟的提取时间。

1.3水解酸浓度的考察：

取本品（批号为ZL02）适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，分别加4%盐酸溶液、8%盐酸溶液、12%盐酸溶液、16%盐酸溶液各10ml，超声处理2分钟,再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定大黄素、大黄酚总量，结果见表3。

表3 四季三黄片水解酸浓度考察试验结果

结果表明：以12%盐酸溶液水解，大黄素、大黄酚总量较高，故选择12%盐酸溶液。

1.4酸水解时间的考察：

取本品（批号为ZL02）适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加12%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟,再加入三氯甲烷10ml，分别加热回流30、60、90分钟，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定大黄素、大黄酚总量，结果见表4。

表4 四季三黄片酸水解时间考察结果

结果表明：12%盐酸溶液水解60分钟为宜，故选择60分钟的酸解时间。

2、专属性试验：

取对照品溶液10µl，注入液相色谱仪，照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1。

取供试品溶液10µl，注入液相色谱仪，照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图2。

取阴性样品溶液10µl，注入液相色谱仪，照上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图3。

结果表明，供试品色谱中与对照品色谱上相同保留时间有对应的色谱峰，峰形良好。以大黄素色谱峰按照公式n=5.54(t_R/W_h/2)²计算，理论塔板数为17381。按照公式R=2(t_R2- t_R1)/( W₁+ W₂)计算，大黄素分离度为6.58，大黄酚的分离度为4.71。阴性样品色谱中，在相同的保留时间无色谱峰，说明本方法专属性良好，阴性无干扰。

3线性试验：

精密称取大黄素照品适量，精密称定，配制成3.270μg/ml、8.176μg/ml、16.35μg/ml、40.88μg/ml、81.76μg/ml、204.4μg/ml的对照品溶液。按照拟订的色谱条件将对照品溶液分别进样10μl，测定峰面积，结果见表5。

表5 大黄素线性考察结果

对大黄素峰面积与进样量进行线性回归处理，得回归方程：

Y=3703.68X+1.645 r=0.9999

以进样量为横坐标相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线如图4.

精密称取大黄酚对照品适量，精密称定，配制成3.219μg/ml、8.048μg/ml、16.10μg/ml、40.24μg/ml、80.48μg/ml、201.2μg/ml的对照品溶液。按照拟订的色谱条件将对照品溶液分别进样10μl，测定峰面积，结果见表6。

表6 大黄酚线性考察结果

对大黄酚峰面积与进样量进行线性回归处理，得回归方程：

Y= 5303.42X+4.308 r=0.9999

以进样量为横坐标相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线如图5。

结果表明，大黄素在进样量0.03270µg~20.44µg 之间呈良好的线性关系。大黄酚在进样量0.03219µg~2.012µg之间呈良好的线性关系。

4、进样重复性试验：

取本品（批号为ZL02）适量，研细，取约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备项下制备。按拟定的测定条件重复进样6次测定，计算相对标准偏差，结果见表7。

表7 四季三黄片含量测定进样重复性试验结果

结果表明，大黄素和大黄酚的相对标准偏差分别为0.20%和0.26%，符合要求。

5、重复性试验：

取本品（批号为ZL02），研细，取约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备项下制备，平行6份。按拟定的测定条件进样10μl测定，计算相对标准偏差，结果见表8。

表8 四季三黄片含量测定重复性试验结果

结果表明，供试品中大黄素、大黄酚总量的平均含量为4.35mg/g，相对标准偏差为1.17%，符合要求。

6、准确度试验：

取本品（批号为ZL02，大黄素平均含量2.066mg/g，大黄酚平均含量2.280mg/g），研细，取约0.25g，精密称定，分别精密加入大黄素对照品0.511mg，大黄酚对照品0.503mg，平行6份，按供试品溶液制备项下制备，按拟定的测定条件进行测定，计算回收率和相对标准偏差，结果见表9、10。

表9 四季三黄片含量测定准确度试验结果（大黄素）

表10 四季三黄片含量测定准确度试验结果（大黄酚）

试验结果表明，大黄素的平均回收率为100.20%，相对标准偏差为0.98%；大黄酚的平均回收率为101.70%，相对标准偏差为1.51%，证明该方法准确度良好。

7、日内稳定性试验：

取本品（批号为ZL02），研细，取约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备项下制备，按拟定的测定条件分别在第0、2、4、6、8、10、12、14小时进样10μl测定大黄素、大黄酚峰面积，计算相对标准偏差，结果见表11。

表11 四季三黄片含量测定日内稳定性试验结果

试验结果表明，供试品溶液在14小时内稳定性良好。

8、耐用性试验

使用不同的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行测定，结果见表12。

表12 四季三黄片含量测定耐用性试验结果

由试验结果可见，使用不同的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，不同的液相色谱进行测定。色谱峰峰型和分离度良好，测定结果基本不受影响，本方法耐用性良好，见图6-8。

8、确定含量测定方法

（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸（79：21）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于12000。

对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含大黄素16μg、大黄酚16μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加12%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

（2）样品测定：

取该品5个批号的样品，按照供试品溶液制备及色谱条件测定样品中大黄素和大黄酚的总量。结果见表13。

表13五批样品含量测定结果

根据以上五批的检测结果，确定四季三黄片中每片含大黄以大黄素（C₁₅H₁₀O₅）和大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）总量计，不得少于0.70mg。

本发明公开的四季三黄片含量测定方法所具有的积极效果在于：

（1）发明了四季三黄片中大黄素和大黄酚总量的测定方法。

（2）增加了含量测定项目，提高了控制药品质量的手段。

附图说明：

图1大黄素、大黄酚对照品色谱图；

图2四季三黄片（批号为ZL02）供试品色谱图；

图3四季三黄片大黄阴性样品色谱图；

图4大黄素标准曲线；

图5大黄酚标准曲线；

图6四季三黄片含量测定耐用性试验——四季三黄片（批号ZL02）供试品色谱图（DIKMA Diamonsil（2）5um 250×4.6mm）；

图7四季三黄片含量测定耐用性试验——四季三黄片（批号ZL02）供试品色谱图

（Agela BonChrom C18 5um 100A 250×4.6mm）；

图8四季三黄片含量测定耐用性试验——四季三黄片（批号ZL02）供试品色谱图

（YMC-Pack ODS-A 5u 12nm 250×4.6mm）。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用药材均有市售。

实施例1

【处方】大黄 240g 黄芩 240g 栀子75g 黄柏240g

【制法】以上四味，大黄粉碎成细粉；黄芩、栀子加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，浓缩成相对密度为1.3（80℃测）的稠膏；黄柏用60%乙醇渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，浓缩成相对密度为1.3（80℃测）的稠膏；将水、醇浓缩膏合并，加入大黄粉末混匀，制成颗粒，干燥，压制成1390片，包薄膜衣，即得。

【性状】本品为薄膜衣片，除去包衣后显棕色；味苦。

实施例2

供试品溶液的制备取本品适量，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加12%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加入三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用1 ml三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。确定四季三黄片中每片含大黄以大黄素（C₁₅H₁₀O₅）和大黄酚（C₁₅H₁₀O₄）总量计为0.723mg。