一种氧化石墨烯辅助的SERS活性基底表面清洁方法与流程

本发明属于化学分析技术领域，主要涉及一种氧化石墨烯辅助的SERS活性基底表面清洁方法。

背景技术：

蛋白质结构是蛋白质功能的基础，测定蛋白质结构是蛋白质研究的重要组成部分。了解蛋白质的结构对于认识、利用和改造蛋白质都具有十分重要的意义。血清蛋白的浓度长期以来一直被视为健康和疾病的一个重要标准。它具有结合和运输内源性和外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。与其他蛋白相比，血清白蛋白分子量小、溶解度大、稳定性较好且容易较大量、高纯度制备。因此血清白蛋白是研究高分子蛋白质的理化性质、生物学功能、体内代谢、临床应用及遗传变异等方面的理想蛋白质，在生物学和临床上均有重要意义。

利用增强拉曼光谱技术可直接分析水相生物分子的结构状态且用量少，与其他方法相比有着明显的优势。更多的研究表明利用增强拉曼光谱手段很好地解决了生物化学、生物物理和分子生物学中的诸多问题。不仅如此，越来越多的科研人员也已经尝试利用增强拉曼光谱技术的非破坏性和指纹式的分辨能力研究蛋白质及其之间的相互作用，并取得了一定的成果。但是其获得的拉曼光谱的重现性和重复性不高，主要原因：实验操作过程繁杂；加入电解质和离心过程会对基底材料的造成大的团聚而不能形成适用于目标分子有效的“热点”。尤其是表面活性剂本身的信号严重干扰检测，且会屏蔽蛋白质与基底的接触，导致无法测得蛋白质信号。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种氧化石墨烯辅助的SERS活性基底表面清洁方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种氧化石墨烯辅助的SERS活性基底表面清洁方法，包括下列步骤：

将氧化石墨烯溶胶和银溶胶均匀混合，超声下加入NaCl溶液，控制NaCl在混合溶液中的最终浓度为0.01～0.05M，银在混合溶液的最终浓度为0.1～0.5g/L，氧化石墨烯在混合溶液的最终浓度为0.01～0.1g/mL，得到表面增强拉曼光谱的微团聚的基底材料；向基底材料中加入HCl溶液调节pH值2.5～3.5。

上述步骤中，银溶胶的制备采用柠檬酸还原法，将硝酸银和柠檬酸三钠混合后煮沸5～8min，后降温至92±2℃加热50～90min，得到银溶胶。

上述步骤中，氧化石墨烯溶胶的制备采用两次氧化法得到氧化石墨烯溶胶。

上述步骤中，向基底材料中加入HCl溶液调节pH≈3。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的最大亮点在于超声条件下依次加入的少量的盐酸盐溶液和盐酸具有协同效应，能降低GO和贵金属纳米粒子表面的带电层，使得贵金属纳米粒子沉积到GO上，同时，又能够快速清洁贵金属纳米材料表面的活性剂柠檬酸根离子，这样GO代替柠檬酸根离子作为“新型表面活性剂”能够较好地保持贵金属纳米粒子的稳定性，而贵金属粒子表面裸露出的部分能够直接与待检测的蛋白质分子等相作用，从而避免了表面活性剂的干扰，实现对蛋白质等生物分子的免标记检测。此方法操作简单，成本低廉和较好的SERS效果等优点，为后续的蛋白质的结构和功能及疾病的诊断研究提供了重复性非常好的方法。

附图说明

图1是本发明制备的改进型银溶胶的TEM图。

图2是本发明制备的改进型银溶胶的UV-vis图。

图3是本发明所述的GO辅助清洁SERS活性基底的TEM图。

图4是利用本发明清洁后的基底材料检测牛血清蛋白得到的表面增强拉曼图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明的机理是：在超声条件下，依次加入的少量的盐酸盐溶液和盐酸具有协同效应，能降低GO和贵金属纳米粒子表面的带电层，使得贵金属纳米粒子沉积到GO上，同时，又能够快速清洁贵金属纳米材料表面的活性剂柠檬酸根离子，这样GO代替柠檬酸根离子作为“新型表面活性剂”能够较好地保持贵金属纳米粒子的稳定性，而贵金属粒子表面裸露出的部分能够直接与待检测的蛋白质分子等相作用，从而避免了表面活性剂的干扰，实现对蛋白质等生物分子的免标记检测。

本发明所述的氧化石墨烯辅助的SERS活性基底表面清洁方法，包括如下步骤：

1)改进型银溶胶的合成：本方法是对Lee和Meisel的合成方法的改进；具体过程是：电热套加热盛有220mL去离子水的三口烧瓶，待溶液沸腾后用移液枪移取1.5mL浓度为30mg/mL的AgNO₃溶液至烧瓶中，等待溶液重新沸腾后，快速加入4.5mL质量分数为1％的新制的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌回流，5分钟后，溶液颜色由无色变为浅黄色，快速加入20mL 20℃蒸馏水，控制电热套温度，使溶液内温度为92±2℃，继续回流反应1h，冷却后定容至250mL，最后所得溶液为橙绿色,记为改进AgNPs，其TEM图和UV-vis图分别见图1和图2。从Ag的UV-Vis谱图可以看出改进型银溶胶只在419nm处有一个强的吸收峰，是银颗粒表面等离子共振产生的，峰型尖锐，说明银纳米粒子尺寸和形貌比较均匀。从TEM可以看出，改进法制备的AgNPs颗粒形貌比较均匀，呈球形或类球形，没有棒状银存在，尺寸在30-40nm之间，分散性良好。

2)采用改进的Hummers法制备GO：两次氧化法。首先将石墨粉过400目的筛子。预氧化：将10g K₂S₂O₈和10g P₂O₅加入到3L三口烧瓶中，在1min内快速加入60mL浓硫酸，不断搅拌并加热至80℃。待烧瓶内白烟消失后，用钥匙缓慢加入过筛的石墨粉20g(前5g非常缓慢)，加热搅拌6h，反应完成后，冷却至室温，抽滤洗涤至pH为7左右；得到蓬松状的滤饼，滤饼在室温下干燥一夜。二次氧化：将460mL浓硫酸加入到3L三口烧瓶中，并处于0℃冰浴环境下，缓慢加入滤饼，保持温度小于20℃，搅拌1h，使滤饼均匀扩散。然后缓慢加入60g KMnO₄，每次小半勺，每次间隔6s。加入完成后，升温至35℃，反应2h，溶液开始逐渐变粘稠。分多次加入920mL的蒸馏水，然后快速升温至98℃，搅拌15min，转移溶液至5L的烧杯中，在搅拌下加入50mL 30％(质量分数)的H₂O₂，然后加入2.8L的去离子水终止反应，所得溶液为亮黄色。抽滤，用稀盐酸(V_HCl:V_H2O＝1:10)洗涤；然后再用去离子水洗涤至用BaCl₂溶液检验滤液无白色沉淀为止(检测SO₄^2-)，得到的滤饼用蒸馏水溶解后，用透析膜透析，每天更换清水，直至pH为7。将透析好的氧化石墨烯配制成一定浓度的溶液，在大功率超声仪下振荡3h，使得石墨烯片碎化为小片。最后通过紫外-可见光谱仪测试吸光度，与标准曲线对比，将石墨烯浓度定量至0.5mg/mL，备用。

3)GO辅助清洁SERS活性基底：a.分别取2mL的银溶胶和0.2mL的氧化石墨烯，在容量为10mL的试剂瓶中均匀混合，超声条件下加入0.1mL浓度为0.55M的NaCl溶液，向微团聚悬浮性基底材料中加入HCl，在GO辅助的条件下实现SERS活性基底表面快速清洁(溶液最终pH在2.5～3.5之间)，得到清洁后的基底材料，其TEM图见图3。可以看出，加入的少量的盐酸盐溶液和盐酸具有协同效应，不仅能清洁纳米银颗粒表面的活性剂柠檬酸根离子，而且能同时降低GO和贵金属纳米粒子表面的带电层，使得贵金属纳米粒子沉积到GO上。形成活性基底材料。

4)将待测血清溶液加入基底溶液中混合均匀，拉曼光谱检测。得到了牛血清蛋白的表面增强拉曼图谱，同时，也做了清洁后的活性基底材料的表面增强拉曼图谱，如图4。可以看出，加入的少量的盐酸盐溶液和盐酸具有协同效应，能够有效地清除纳米银颗粒表面的活性剂柠檬酸根粒子，形成的活性基底材料能够有效地吸附牛血清蛋白质分子，并产生良好的牛血清蛋白的SERS信号。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。