一种基于非聚集的银包金纳米粒子的毒品检测比色传感器的制作方法

【技术领域】

本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种生物样品和环境样品中的毒品的检测。

背景技术：

毒品滥用已经成为了一个全球性问题，其可以导致一系列严重的社会问题，比如说，给成瘾者的生命健康带来损失和威胁，浪费金钱以及导致高的犯罪率。联合国毒品与犯罪办公室最近统计了一组数据，在2013年，大约246百万人，大约全球5％，年龄段在15到60岁之间的人至少吸过一次毒。以甲基苯丙胺和可卡因为例，甲基苯丙胺在全球的滥用量排名第二，仅次于大麻。最近几年，在一些国家和地区，甲基苯丙胺的滥用量还有上升的趋势。例如，在东亚和东南亚地区，甲基苯丙胺的缴获量从2010年的7吨上升到2014年14吨，增加了一倍。可卡因的情况也同样不容乐观，可卡因在拉美地区和加勒比海地区仍然是使用量最大的毒品，在美国和欧洲也是滥用量第二大的毒品。因此，为了监测和控制毒品的滥用，针对不同的样品，包括成瘾者的血液，尿样以及一些地区的废水，都需要分析。

传统的分析毒品的方法有气质联用、液质联用、离子淌度谱法、成像质谱、sers等等。尽管这些技术具有高灵敏和高选择性，但是它们要求昂贵的设备以及在实验室进行复杂的样品前处理技术。这些不足都限制了它们更加广泛地使用以及临场监测。也就是说，还需要发展简单，价格低廉且有效的检测方法来快速准确的现场检测低浓度的毒品。

传统方法的限制有可能被生物传感器所克服，生物传感器是一种小型的设备，该设备具有一个生物受体，以及根据目标物的存在，这个受体能产生一个识别信号，如电化学，光学，纳米力学，质量敏感性等。由于其微型化，具有设计成便携式的潜力以及用极少的样品就可以测定复杂样品中待测物质等优势，它很有希望在未来应用到体液或者环境样品的实时监测。在过去十几年，生物传感器被用于检测各种样品中的各种目标物质，如重金属离子、小分子、目标dna、多肽、酶、蛋白质、生物标记物、甚至细菌等。

在这些传感器种类中，基于贵金属纳米材料，特别是金纳米材料的生物传感器在分析领域具有很广泛的应用，这是因为它们制备方法简单并且还有很好的光学性质，这些光学性质发展出了很多分析方法，例如比色法、光散射法、扫描法、表面增强拉曼、以及化学发光法等。其中比色法由于其简单、价格低廉、以及相容性好等无可比拟的优势受到日益增强的关注。寡聚核苷酸修饰的纳米金第一次用于检测是由mirkin课题组完成的，在它们设计的系统中，分散的寡聚核苷酸修饰的纳米金，通过dna互补形成杂交网络从而引起聚集。这会使得纳米金的spr(表面等离子体共振)的信号不光是强度还是峰位置都会发生显著的变化。从裸眼来看，就是纳米金的颜色由红色变为蓝色。但是，这种设计仍然有一些缺陷存在，比如说，当使用纳米金检测低浓度的目标物时，其效率受聚集沉淀所限制，此外，基于聚集态的纳米金来进行检测具有较差的重现性。我们也注意到用银染法来使得纳米金信号放大用于定量检测生物分子，虽然这些方法为高灵敏检测目标物质，但是，它的确增加了检测的复杂性。除此以外，为了能够得到更高的灵敏度和更低的检测线，纳米金的spr信号强度也有提升的空间。正是基于以上考虑，我们尝试着搭建一个简单、快速、高灵敏的比色方法用于毒品的检测。

技术实现要素：

为解决现有技术中的上述问题，本发明提出一种简单有效，价格低廉且免标记的，基于非聚集的银包金纳米粒子的比色传感器用于毒品的检测。

一种基于非聚集的银包金纳米粒子的毒品检测比色生物传感器，其特征在于：

该生物传感器由报告探针、捕获探针和适配体组成，其中：

报告探针是由修饰有报告探针序列的银包金构成，捕获探针是由修饰有捕获探针序列的磁珠构成，适配体通过与报告探针序列和捕获探针序列通过碱基互补配对形成dna双链，从而形成au@ag-dsdna-mbs三明治结构。

一种基于本发明的生物传感器进行毒品检测的方法，其特征在于：

将待测对象加入到适配体溶液中，然后加入缓冲液，温育一段时间，将捕获探针和报告探针加入到溶液中，震荡、杂交后，用外部磁场去除三明治结构，去除后，上清液进行可见光谱测试。

基于非聚集的银包金纳米粒子的毒品检测比色生物传感器的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：银包金的合成，用金种生长法合成银包金；

步骤二：报告探针的制备，报告探针是由一段与适配体部分互补配对的rpdna修饰在银包金上组成；

步骤三：捕获探针的制备，捕获探针是由一段与适配体部分互补配对，但是配对位置与rpdna配对位置不重合的cpdna通过偶联作用修饰在羧基功能化的磁珠上组成。

进一步优选方式为：

报告探针是用能与适配体部分互补的报告探针序列修饰在确定粒径的银包金上而组成。

更进一步优选方式为：

报告探针序列通过巯基将其修饰到合成好的银包金上。

更进一步优选方式为：

将待测对象加入到适配体溶液中，然后加入缓冲液，温育一段时间，将捕获探针和报告探针加入到溶液中，震荡、杂交后，用外部磁场去除三明治结构，去除后，上清液进行可见光谱测试。

本发明提出了一种简单有效，价格低廉且免标记的，基于非聚集的银包金纳米粒子的比色传感器用于毒品的检测。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

【附图说明】

图1对于毒品检测的原理示意图；

图2不同浓度的甲胺的测定；

图3有或无甲胺的检测结果图；

图4条件优化实验结果图；

图5抗干扰性试验结果；

图6用本发明方法和传统方法测定甲胺的结果比较。

【具体实施方式】

本发明提出了一种简单有效，价格低廉且免标记的，基于非聚集的银包金纳米粒子的比色传感器用于毒品的检测。下面就本发明的具体实施方式作进一步介绍。

实施例一：一种基于非聚集的银包金纳米粒子的毒品检测比色生物传感器

该生物传感器由报告探针、捕获探针和适配体组成，其中：报告探针是由修饰有报告探针序列的银包金构成，捕获探针是由修饰有捕获探针序列的磁珠构成，适配体通过与报告探针序列和捕获探针序列通过碱基互补配对形成dna双链，从而形成au@ag-dsdna-mbs三明治结构。

如图1所示为本发明对于毒品的检测的一般性原理示意图，其中附图标记1-10表示的对象如下：1.银包金核壳纳米粒子；2.羧基磁珠；3.报告探针dna；4.捕获探针dna；5.报告探针；6.捕获探针；7.适配体；8.毒品；9.毒品-适配体复合物；10.银包金-双链dna-磁珠三明治结构复合物。

本发明尝试着构建一个基于非聚集的银包金的简单，快速，价格低廉且有效的毒品检测策略。在这个系统中，有两种探针(报告探针和捕获探针)被用来识别适配体。报告探针是用能与适配体部分互补的报告探针序列修饰在40nm的银包金上而组成。报告探针序列通过巯基将其修饰稳定的银包金上，另外一种探针是能促进分离的羧基包裹的磁珠构成.这些磁珠通过羧基与修饰有氨基的捕获序列在edc的偶联作用下而构成捕获探针。

适配体可以分别与报告探针和捕获探针上的序列在不同的区域进行识别然后进行互补配对从而形成au@ag-dsdna-mbs三明治复合物结构。三明治复合物结构可以在外部磁场作用下进行去除。三明治结构的去除可以降低银包金的spr信号强度。因此，通过消除了三明治结构的上清液就可以用来进行比色观察降低情况。但是，在毒品存在的情况下，毒品将与适配体进行特异性的结合从而形成毒品-适配体复合物，这种复合物的形成将阻止三明治结构的形成。如图2所示，随着毒品的量的增加，上清液的颜色将由浅黄变为深黄，这个现象可以用肉眼进行观察。包含有银包金的上清液也将用于紫外-可见吸收光谱进行测试以定量毒品。本发明的设计就是基于以上原理来实现毒品的检测，根据本发明的设计，au@ag核壳纳米粒子在适配体存在的情况下只与磁珠结合，而不会造成银包金彼此之间的聚集。所以也不会有共振峰的红移现象出现，这个简单的设计避免了基于经典的纳米金比色法由于聚集而造成的复杂光谱的形成。并且，溶液的颜色也不会因为聚集发生变化，而是总是黄色，只是在亮度上有变化。此外，非聚集的au@ag核壳纳米粒子也减少了因聚集而导致聚集体的形成所带来的实验误差。

为了测该实验方案的可行性，本发明以甲胺(甲基苯丙胺)为代表，进行了在有或者无甲胺的情况下，观察测定上清液银包金的强度变化。如图3所示为检测结果图(1.银包金；2.磁珠+银包金+甲基苯丙胺；3.磁珠+银包金+适配体+甲基苯丙胺；4.磁珠+银包金+适配体)，控制实验中，只有报告探针和捕获探针的银包金的绝对吸光度为0.46(mbs+au@ag)。当加入甲胺之后，吸光度没有发生显著的变化(mbs+au@ag+meth)。这说明，单独的甲胺对这个系统没有影响。当甲胺适配体加入到控制实验后，吸光度显著的降低(mbs+au@ag+apt)。这是因为适配体跟探针序列形成了双链，从而形成了au@ag-dsdna-mbs三明治复合结构。这种复合结构被外部磁场清除。银包金随着三明治结构的清除也被去除，从而导致了银包金的spr信号在强度上发生了变化。当甲胺及其适配体同时存在的情况下，银包金的强度显著的恢复(mbs+au@ag+apt+meth)。恢复的信号只比控制实验中银包金的强度略低。这说明，甲胺跟适配体由于形成了甲胺-适配体复合物，该复合物阻止了au@ag-dsdna-mbs三明治结构的形成，因而银包金不能被外部磁场去除。正是由于在检测过程中，只有稳定且分散的银包金纳米粒子，我们只需要关注银包金的spr信号强度的变化而不用担心因为银包金的聚集而导致复杂光谱形成所带来的变化。并且，由于没有聚集的银包金聚集体形成，实验具有更好的重现性。以上这些结果说明，该设计原理用来检测甲胺是可行的。

为了确定设计方案的有效性，同样以广泛滥用的甲胺为代表，来进行以非聚集的银包金为原理的毒品检测实验：10μl1μmmeth加入到10μl200nmmeth适配体溶液中，然后加入20μlpbs-t缓冲液，温育半个小时，捕获探针(5μl，pbs-tbuffer)和报告探针(50μl，pbs-tbuffer)加入到溶液中，然后加入pbs-t使总体积为100μl，震荡90分钟。杂交后，用一个永磁铁放在管壁外约1min，无论是否形成三明治结构的磁珠都会通过外部磁场进行去除。去除后，取上清液进行紫外可见光谱测试。所有的程序都在室温25℃下进行。

控制实验如下：mbs+au@ag；mbs+au@ag+meth；mbs+au@ag+apt。在这些试验中，每个成分都加入跟有甲胺的情况下，相同的体积和浓度。没有的成分用pbs-t代替，使最终体积为100μl。

实施例二：基于非聚集的银包金纳米粒子的毒品检测比色生物传感器的构建方法

步骤一：银包金的合成

银包金纳米粒子用金种生长法合成，具体过程示例如下：

30nm的纳米金粒子通过柠檬酸钠还原氯金酸的方法来合成。即，50ml0.01％(w/w)haucl4被750μl1％(w/w)柠檬酸钠还原。反应温度在100℃，经过15-20分钟的激烈的磁珠搅拌，溶液由无色变为浅红色。银包金采用金种法合成，准备好的纳米金粒子作为金种子。然后600μl的agno3溶液(0.5％，w/w)加入到100ml沸腾的金种子溶液中取。稍后，1ml的柠檬酸钠溶液(1％，w/w)作为还原剂在搅拌的情况下逐滴加入。混合溶液沸腾反应1小时后停止加热。合成的核壳纳米结构的银包金冷却到室温备用。

可以通过以下方式来确认是否成功合成银包金纳米粒子：

合成好的银包金纳米粒子通过扫描电镜和高分辨透射电镜进行表征，银包金的纳米粒子粒径均匀约为40nm。由于纳米金跟银包金的表面等离子共振的频率不一样，通过紫外吸收光谱表现出来的spr信号也不一样。因此，通过紫外-可见光谱可以进一步证明银材料是否成功的包裹在纳米金粒子上。如图2所示反映了纳米金和银包金的紫外-可见吸收光谱情况。通过与纳米金的紫外吸收峰比较，银包金的紫外可见吸收峰发生了蓝移。并且，从透射电镜也可以看出银包金纳米粒子外围的与内核的透明度不一样，这是因为由于金银的物理性质不同，因而其各自的衬度不一样。不仅如此，同一浓度下的银包金的spr信号强度远比纳米金的强。这意味着利用银包金比利用纳米金能够获得更高的灵敏度和更低的检出限。综上所述，银包金纳米粒子被成功的合成。

步骤二：报告探针的制备

报告探针是由一段与适配体部分互补配对的rpdna修饰在40nm银包金上组成。其修饰方法是将柠檬酸根稳定的银包金纳米粒子与巯基修饰的rpdna混合。具体过程示例如下：

15nmol巯基功能化的rpdna加入到5mlau@ag的pb(磷酸盐)缓冲液中(ph7.4，10mm磷酸钠缓冲液)，经过24小时，2mnacl溶液加入到混合液中并使得最终溶液为浓度0.05m，静置8小时，继续加入氯化钠溶液使得最终浓度为0.1m，陈化40小时，溶液在离心机以6500rpm的情况下离心15分钟，然后用pbs-t缓冲液重悬(ph7.4，10mm磷酸钠缓冲液，0.05％吐温-20)，此过程重复进行三次。

步骤三：捕获探针的制备

捕获探针采用具有磁性的磁珠可以方便的通过利用外部磁场来去除。这些磁珠被羧基功能化且与适配体部分互补但不在与报告探针同一识别区的捕获探针序列通过edc偶联反应来修饰。具体过程示例如下：

捕获探针使用直径为1μm的羧基包被的磁珠。取2.5ml的磁珠(10mg/ml)，使用2.5ml的mes缓冲溶液洗涤两次，并重悬于250μl的mes溶液中。将36.2nmol氨基功能化的cpdna与36.2μmol的edc在100μlmes溶液中混合，并加入到磁珠溶液中，室温剧烈震荡过夜。然后与50mm的tris缓冲溶液混合15分钟，用于猝灭未反应的羧基活化基团。施加外部磁场去除上清液，并再次重悬于tris缓冲溶液中，重复以上步骤2次。最终将磁珠重悬于pbs-t缓冲溶液中，最终制得捕获探针放置在4℃情况下备用。

如图4所示为条件优化实验，包括磁珠体积优化、杂交时间优化、适配体浓度优化。

磁珠的浓度将影响溶液中报告探针和捕获探针的的比例，这将会对实验的灵敏度有影响。为了优化磁珠浓度，不同浓度的磁珠将被优化，然后选择最佳浓度进行接下来的实验。优化实验跟上面提到控制实验：mbs+au@ag+apt程序相同，磁珠(10mg/ml)的体积梯度为0，0.1，0.5，1，和5μl。

磁珠的浓度会引起报告探针和捕获探针之间比例的改变，太多的磁珠会造成浪费而较少的磁珠将对实验的灵敏度造成影响。为了得到磁珠的最佳浓度，在不改变报告探针和适配体浓度的情况下，进行了一系列磁珠浓度梯度实验，然后选择最佳磁珠使用量。如图4所示当磁珠体积使用量超过1μl时，银包金信号不再发生变化并达到最低值。考虑到经济性，最终选择1μl磁珠用量作为实验条件。

对于本发明，杂交反应时间，即三明治结构复合物的形成也是一个重要的参数。本发明研究了银包金的spr信号随时间的变化情况，实验过程跟控制实验mbs+au@ag+aptamer相同，时间范围为0到105min。每隔15min测一次。

在该实验中需要找到能够刚好将全部报告探针都去除的适配体的最佳浓度，因此我们需要测定随着适配体浓度的变化，银包金在400nm处的吸收强度。实验过程跟跟控制实验mbs+au@ag+apt相同，适配体最终浓度梯度为0，10，20，30，40，50，和60nm。

在优化实验条件下，该方法对甲胺的灵敏度和线性检测范围进行确定。甲胺的浓度梯度为0，0.50，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.00，80.0，100.0，150.0，200.0nm.

为了展示该方法在实际样品中的应用情况，甲胺成瘾者的尿样用于该实验进行检测。尿样经过0.22μm针头式水相过滤器过滤，每个样品取20μl加入到检测系统。测定的浓度与(hplc-ms/ms)测定的结果进行比较，为了查看该方法的回收率，进行加标试验，分别加入甲胺使得加入的最终浓度10，50，和100nm.然后加标样品利用该比色方法进行测定，试验结果如下表所示。

为了验证本发明检验方法的抗干扰性，本发明选择性通过其他8种常见的毒品或者代谢物进行验证。如图5所示为验证结果，从左到右依次为：meth：甲基苯丙胺；nk：去甲氯胺酮；ket：氯胺酮；mor：吗啡；coc：可卡因；cat：卡西酮；mcat：甲卡西酮；bzp：苄基哌嗪；mda：替苯丙胺；blank，空白。试验程序跟跟上面实验过程相同，除了甲胺被其他毒品或者代谢物代替，并且其中其他毒品的浓度(1μm)比甲胺的50nm浓度更高。由图5所示的验证结果，其他毒品对甲胺的检测几乎没有干扰，本发明的传感器具有很好的抗干扰性。

为了展示该方法对所有毒品具有普适性，我们将另外一种应用广泛的毒品，可卡因应用到该检测系统中，构建一个基于可卡因的检测策略。实验过程跟上面甲胺的测定程序相同，除了以下一些地方在预实验和控制实验中，可卡因的浓度150nm；2)在可卡因适配体优化实验中，适配体浓度梯度为0，5，10，15，20，30，40，和50nm；3)在灵敏度和线性范围试验中，可卡因浓度为0，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，和150.0nm。因此，只要通过简单的寡聚核苷酸序列的替换而不用改变其它结构，就能实现对其他对应的毒品进行检测。这证明了该方法针对毒品的检测具有普适性。

如图6所示为用本发明方法(图中浅黑色所示)和传统方法(图中深黑色所示)测定甲胺的结果比较，通过对比发现，本发明的实验结果跟液质测定方法测定结果几乎一致。根据以上结果可以预见，基于银包金的比色检测策略在未来具有很大的潜力用于生物样品和环境样品中的毒品的检测。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。