蜘蛛乙酰胆碱结合蛋白在配体门控离子通道配体筛选中的用途的制作方法

技术领域本发明属于生物技术领域，涉及一种可溶性配体结合蛋白及其结构与模型在配体门控离子通道配体筛选中的用途。

背景技术：
乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcholinereceptor)是位于细胞膜上的重要功能性蛋白，属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族。在神经系统及神经与肌肉连接处介导快速胆碱能。乙酰胆碱受体是跨膜蛋白复合体，由五个亚基组成，分布在细胞表面，这五个亚基环形排列形成一个中央离子通道。它们就像一个分子开关，当与乙酰胆碱等配体结合后构象发生改变，通道就会打开允许离子进出细胞，产生细胞电势变化和电流变化，从而完成神经信号的传递。乙酰胆碱受体广泛分布于人类、动物和昆虫等生物的神经系统中，同时具有神经递质受体和离子通道的功能，调控生物体的神经传递及相应的生理机能，维持生物体的正常生命活动。在人类中乙酰胆碱受体与阿尔兹海默症(老年性痴呆)、重症肌无力及帕金森症等疾病密切相关。很多的药物和相关疗法的靶标即是乙酰胆碱受体。类似的，在昆虫中，烟碱型乙酰胆碱受体(nachrs)作为昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体，是新烟碱类、多杀菌素类、沙蚕毒素类、砜亚胺类、丁烯酸内酯类等多类杀虫剂和天然产物烟碱等的作用靶标，在害虫治理及杀虫剂开发中占有非常重要的地位。另外，乙酰胆碱受体蛋白也是一些兽药的作用靶标，用于治疗哺乳动物的寄生虫病等。因此，乙酰胆碱受体对于无论是医药、兽药还是杀虫剂等配体化合物的开发与创制具有非常重要的应用价值。

乙酰胆碱受体是由5个跨膜蛋白单体组成的蛋白复合体，对其结构与功能的研究非常困难，因此利用乙酰胆碱受体进行配体筛选，继而开发相应的药物或杀虫剂，也面临着巨大的困难。与乙酰胆碱受体不同，乙酰胆碱结合蛋白(acetylcholinebindingprotein)是由多个蛋白单体组成的可溶性蛋白复合体，其功能结构域与乙酰胆碱受体等配体门控离子通道受体的非跨膜胞外功能区极其相似。乙酰胆碱结合蛋白的可溶性及其功能结构域与配体门控离子通道受体功能区相似的特点，使得乙酰胆碱结合蛋白非常适用于配体门控离子通道受体的配体筛选。虽然目前在水生软体生物如静水椎实螺(lymnaeastagnalis)和海蜗牛(aplysiacalifornica)等中发现乙酰胆碱结合蛋白，但由于水生软体动物乙酰胆碱结合蛋白与农药、医药、兽药等药物亲和力低，因此，水生软体生物的乙酰胆碱结合蛋白应用到昆虫、哺乳动物及人类非常适用于配体门控离子通道受体的配体筛选还存在很多不足。

技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种来自蛛形纲(arachnida)物种的乙酰胆碱结合蛋白用于配体门控离子通道受体的配体筛选。

本发明的另一目的是提供一种蛛形纲(arachnida)物种的乙酰胆碱结合蛋白的制备方法。

本发明的又一目的是提供一种蛛形纲(arachnida)物种的乙酰胆碱结合蛋白的应用。

作为本发明的一种优选，所述的乙酰胆碱结合蛋白来自蛛形纲(arachnida)蜘蛛目(araneida)的物种。

作为本发明的进一步优选，所述的乙酰胆碱结合蛋白来自蛛形纲(arachnida)蜘蛛目(araneida)的拟环纹豹蛛(pardosapseudoannulata)、美国流浪蛛(cupienniussalei)、温室希蛛(parasteatodatepidariorum)、社会绒蜘蛛(stegodyphusmimosarum)和捕鱼蛛(dolomedessulfureus)。

作为本发明的进一步优选，所述的乙酰胆碱结合蛋白来自蛛形纲(arachnida)蜘蛛目(araneida)的拟环纹豹蛛(pardosapseudoannulata)。

一种蛛形纲(arachnida)物种的乙酰胆碱结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)克隆乙酰胆碱结合蛋白并构建重组质粒；

(2)根据所选用的人工表达系统不同，直接使用所述的重组质粒，或将所述的重组质粒进行体外转录获得目的基因的crna，或将所述的重组质粒转入转染用的病毒；

(3)依据所选用的人工表达系统不同，将所述的重组质粒或crna或含有目的重组质粒的病毒通过适用于该人工表达系统的方法将上述质粒或crna或病毒转入到表达系统中；

(4)依据所用表达系统不同，培养适当的时间后，即可表达获得乙酰胆碱结合蛋白。

本发明所述的乙酰胆碱结合蛋白在用于配体门控离子通道受体的配体筛选中的应用。

一种筛选配体门控离子通道受体的配体的方法，包括以下步骤：将利用本发明所述的制备方法获得的昆虫乙酰胆碱受体蛋白复合体与待筛选配体相接触、反应，检测乙酰胆碱结合蛋白和配体结合的相应参数及乙酰胆碱结合蛋白结构的变化，从而完成配体的筛选。

有益效果：

本发明与现有的配体门控离子通道受体的配体的方法相比，其优点和积极效果表现为：

在进化的亲缘关系上蛛形纲物种比水生物种更接近昆虫及哺乳动物，因此本发明中所述的乙酰胆碱结合蛋白更能体现昆虫及哺乳动物配体门控离子通道受体的结构与功能特性，用本发明中所述的乙酰胆碱结合蛋白筛选获得的配体，可以更加高效的用于昆虫、哺乳动物和人的配体门控离子通道受体的配体的开发与创制。

附图说明

附图1乙酰胆碱结合蛋白表达后的检测结果，泳道1为蛋白标准，泳道2为乙酰胆碱结合蛋白，泳道3为阴性对照。(a)变性条件下乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp)的westernblot检测；(b)天然(native)条件下乙酰胆碱结合蛋白的westernblot检测。

附图2拟环纹豹蛛(pp-achbp)和静水椎实螺(ls-achbp)的乙酰胆碱结合蛋白对配体的结合。(a)对地棘蛙素的结合情况；(b)对银环蛇素的结合情况；(c)对吡虫啉的结合情况。

附图3乙酰胆碱结合蛋白与吡虫啉的分子对接。(a)拟环纹豹蛛乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp)与吡虫啉的分子对接；(b)静水椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白(ls-achbp)与吡虫啉的分子对接。

具体实施方案

实施例1

1.本实施例以来源拟环纹豹蛛的乙酰胆碱结合蛋白，以sf9细胞为人工表达系统，来说明具体实施方式，但本方法并不局限于本例所述的材料和表达系统。同时，使用sf9细胞人工表达系统进行了对照实验。对照实验1为目前发现的水生软体动物中的乙酰胆碱结合蛋白，具体为静水椎实螺(lymnaeastagnalis)的乙酰胆碱结合蛋白。对照实验并非本方法必须的实验，此处是为了证明本方法真实有效。

目的基因的克隆和质粒构建

(1)取拟环纹豹蛛头胸部约100mg，用trizol法提取总rna，以提取的总rna为模板合成cdna第一条链；

(2)查询ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得拟环纹豹蛛和静水椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白的基因序列，拟环纹豹蛛的乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp1)的登陆号为ky765678，静水椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白(ls-achbp)的登陆号为aak64377.1。然后设计引物，以步骤(1)合成的cdna第一条链为模板，通过rt-pcr方法分别克隆上述基因中包含的cds序列。

(3)pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标dna片段；

(4)回收的目标片段分别通过transpeasy-bluntcloningkit插入至peasy-blunt载体中，插入位点分别为pp-achbp1，bamhi和xbai；ls-achbp，bamhi和xbai。然后转化到t1大肠杆菌，涂于含x-gal0.02g/ml、iptg0.2g/ml以及氨苄青霉素50ng/ml的lb培养基，37℃培养，过夜；

(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子，并测序验证；

(6)使用各亚基片段对应的dna限制性内切酶及dnat4连接酶将验证过的目标片断分别切下并分别重新插入含有启动子及抗性基因(如抗氨苄青霉素基因等)的质粒中(本实例中使用的为pfastbac1，抗氨苄青霉素，购买自invitrogen公司)，插入位点与步骤4中叙述的插入位点相同。然后转化到大肠杆菌dh10bac，涂于含有抗性(庆大霉素、四环素和卡那霉素三种抗生素)的lb固体培养基平板上的lb培养基，37℃培养，过夜，挑选白色单菌落，获取重组质粒。

(7)用庆大霉素、四环素和卡那霉素三种抗生素的lb培养液将重组子扩增，提取获得乙酰胆碱结合蛋白的重组质粒。

2.sf9细胞转染

使用iireagent转染试剂，按照试剂盒的使用说明，将鉴定正确的重组质粒转染到sf9细胞中，获得重组杆状病毒。

3.目的蛋白的表达

在培养皿中加入细胞活力大于95％的sf9细胞，27℃培养箱中静置1h，加入每孔终体积1/20的高滴度病毒，轻轻摇匀，27℃培养箱中培养72h。培养72h后吸取培养基，1500g离心5min，上清液即包含目的蛋白。图1a为上清液westernblot的检测结果，表明pp-achbp1已经成功表达。图1b为上清液nativewesternblot的检测结果，表明pp-achbp1能够形成多聚体。

4.目的蛋白纯化

蛋白纯化可以利用本领域中多种常规技术手段实现。本实施例中使用亲和层析方法获得2μg/ml的纯化蛋白，用于配体结合能力的检测。

5.本实施例中使用放射性配基结合实验检测了地棘蛙素、银环蛇素和吡虫啉三种配体与拟环纹豹蛛和静水椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白结合能力的差异。图2a-c分别显示出地棘蛙素、银环蛇素和吡虫啉与拟环纹豹蛛的乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp)和静水椎实螺的乙酰胆碱结合蛋白(ls-achbp)的不同结合能力。结果表明，拟环纹豹蛛的乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp)对吡虫啉具有更高的结合能力。这表明拟环纹豹蛛的乙酰胆碱结合蛋白(pp-achbp)在不同配体间存在选择性，更有利于药物的筛选。

实施例2

本实例选取ls-achbp的2zju为模板，通过构建乙酰胆碱结合蛋白的三维结构模型和分子对接来说明具体实施方式，但本方法并不局限于本例所述的模板和软件包。同时，使用ls-achbp的晶体结构做为分子对接的对照，对照实验并非本方法必须的实验，此处是为了证明本方法真实有效。

选取ls-achbp的2zju为模板，利用discoverystudio3.5软件包(accelrysinc.)，参照discoverystudio的使用说明，对pp-achbp进行同源模建获得pp-achbp的三维结构模型，然后通过分子对接，分析乙酰胆碱结合蛋白对配体吡虫啉的结合能力。分子对接结果(图3)表明，pp-achbp与吡虫啉的作用更强。

本发明为详细记载的内容，如已知基因的克隆、蛋白纯化和分子对接等均可通过本领域常规技术手段实现。