一种CA15‑3半定量检测试剂盒及制备工艺的制作方法

本发明属于医学检验领域，涉及一种ca15-3半定量检测试剂盒及制备工艺。

背景技术：

肿瘤相关抗原ca15-3是位于细胞膜上的一种分子量较大的粘液样糖蛋白，为muc1基因的产物，其最初由两种单克隆抗体所识别，分别是人乳脂肪球膜上糖蛋白mam-6制成的抗体(115-db)和肝转移乳腺癌细胞膜制成的抗体(df-3)。乳腺癌患者常有ca15-3升高，初期敏感性较低，但ca15-3在反映乳腺癌转移方面有较好的敏感性和特异性。除此之外，ca15-3检测比临床症状的出现及影像学检查(如b超、x线或ct等)检出复发和转移的时间要早数月。因此ca15-3可用于作为乳腺癌辅助诊断指标，也是用于术后随访，动态追踪、疗效判定、检测肿瘤复发，转移的重要指标，一般参考值范围<30iu/ml。

临床检测ca15-3的方法有放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(elisa)、化学发光免疫分析(clia)和电化学发光免疫分析(ecla)等。放射免疫分析方法是临床比较常用的方法，但存在操作繁琐，耗时长，且容易产生环境污染，并对操作者产生危害等缺点，现已基本退出市场。目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术，这两种方法原理相似，且已实现自动化、大批量、定量检测，但是存在方法间结果差异大，同时，自动化检测目前由国外大厂商所垄断，仪器设备昂贵，并且不适合单人份和较小批量检测用，大大限制了其在基层医院、诊所的应用。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由faμlk和taylors始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体特异性反应的一种新型免疫标记技术，现已成功用于流式细胞仪、免疫印迹、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(poct)中得到了广泛应用。

将免疫胶体金技术应用于临床检测ca15-3，与传统的elisa技术相比，既保留了elisa技术的敏感性和特异性，又保证了检测结果的可靠性及稳定性，适用于单人份使用，具有操作简便、反应快速、无需任何仪器设备、结果判断直观可靠、经济实用、适合现场检测等优点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用免疫胶体金技术、双抗夹心法原理制备的ca15-3半定量检测试剂盒及其制备工艺，敏感性和特异性好，检测结果可靠稳定，适用于单人份使用，操作简单、反应快速。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种ca15-3半定量检测试剂盒，包括检测板、缓冲液和吸管三个部分，所述检测板包括试纸条和塑料模具，所述试纸条是在塑料模具底板依次粘贴包被膜、吸水垫、标记垫、样品垫组装而成，所述包被膜上包被有羊抗鼠igg、羊抗兔igg和ca15-3单克隆抗体2，从靠近吸水垫的一端到靠近标记垫的一端依次为质控线、参照线和检测线；所述标记垫上包被有ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg。

所述的ca15-3半定量检测试剂盒的制备工艺，采用双抗夹心法免疫层析诊断技术，包括以下步骤：

(1)包被膜的制备：配制0.015m，ph7.4±0.1的磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液；用包被缓冲液将ca15-3单克隆抗体2稀释至0.5mg/ml，羊抗兔igg稀释至0.1mg/ml，羊抗鼠igg稀释至1.0mg/ml，使用连续点膜机以1.0μl/ml的喷量将其以5mm的间隔均匀喷印于硝酸纤维素膜上，将其烘置于37℃烘箱内烘干，然后加入干燥剂，铝箔袋内封存备用；

(2)标记垫的制备：利用柠檬酸钠还原氯金酸分别制备粒径为20～40nm的ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg的胶体金溶液，将制备好的胶体金溶液稀释至od＝30，利用划膜喷金标机以2.0μl/ml的喷量将其以8mm的间隔均匀喷印于聚酯纤维素膜上，将其烘置于37℃烘箱内烘干，然后加入干燥剂铝箔袋封存备用；

(3)样品垫的制备：配制含有1-1.5％三羟甲基氨基甲烷、0.05-1％聚乙烯吡咯烷酮、0.05-1％表面活性剂s9、1-5％鼠抗人红细胞单克隆抗体以及0.05-0.1％酪蛋白的ph为8.0±0.5的纯化水溶液作为样品垫处理液；将样品处理液均匀喷洒在样品垫上，取出后37℃烘箱内烘干；

(4)试纸条的组装及切割：将塑料底板、包被膜、吸水垫、标记垫和样品垫按顺序依次粘贴后，用切条机将其切成试纸条，装入模具中；

(5)缓冲液的配制：配制含有0.01-0.1m磷酸氢二钠及0.01-0.2m氯化钠，ph为7.4±0.1的纯化水溶液。

优选地，所述制备工艺步骤(1)中的硝酸纤维素膜的尺寸为25mm×310mm。

优选地，所述制备工艺步骤(2)中的聚酯纤维素膜的尺寸为10mm×310mm。

本发明可半定量检测出全血、血清及血浆中ca15-3的含量，对于已确诊乳腺癌患者进行疾病动态检测，以辅助判断疾病进程或治疗效果有着积极的意义。与传统的elisa技术相比，本发明操作更加简单，同时保留了elisa技术的敏感性和特异性，检测结果的可靠性及稳定性。除此之外，本发明容易被基层掌握并大面积推广，能广泛应用于医院、诊所、防疫站等大批量使用单位或单人份使用，具有操作简便、反应快速、无需任何仪器设备、结果判断直观可靠、经济实用、适合现场检测等优点。

附图说明

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为ca15-3半定量检测试剂盒的结构示意图。

图2为ca15-3半定量检测试剂盒的检测板的结构示意图。

图3为ca15-3半定量检测试剂盒检测时加样及检测结果示意图。

具体实施方式

如图1所示，ca15-3半定量检测试剂盒，包括检测板1、缓冲液2和吸管3三个部分；如图2所示，所述检测板1包括试纸条和塑料模具4，所述试纸条是在塑料模具底板依次粘贴包被膜5、吸水垫6、标记垫7、样品垫8组装而成，所述包被膜5上包被有羊抗鼠igg、羊抗兔igg和ca15-3单克隆抗体2，从靠近吸水垫6的一端到靠近标记垫的一端依次为质控线(c)9、参照线(r)10和检测线(t)11；所述标记垫7上包被有ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg。

实施例1

一、ca15-3半定量检测试剂盒的制备工艺步骤：

(1)包被膜5的制备：配制0.015m，ph7.3的磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液；用包被缓冲液将ca15-3单克隆抗体2稀释至0.5mg/ml，羊抗兔igg稀释至0.1mg/ml，羊抗鼠igg稀释至1.0mg/ml，使用连续点膜机以1.0μl/ml的喷量将其以5mm的间隔均匀喷印于硝酸纤维素膜上(膜尺寸为25mm×310mm)，将其烘置于37℃烘箱内烘干14小时，然后加入干燥剂，铝箔袋内封存备用；

(2)标记垫7的制备：利用柠檬酸钠还原氯金酸分别制备粒径为20nm的ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg的胶体金溶液，将制备好的胶体金溶液稀释至od＝30，利用划膜喷金标机以2.0μl/ml的喷量将其以8mm的间隔均匀喷印于聚酯纤维素膜上(膜尺寸为25mm×310mm)，将其烘置于37℃烘箱内烘干14小时，然后加入干燥剂铝箔袋封存备用；

(3)样品垫8的制备：配制含有1％三羟甲基氨基甲烷、0.05％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％表面活性剂s9、1％鼠抗人红细胞单克隆抗体以及0.05％酪蛋白的ph为7.5的纯化水溶液作为样品垫处理液；用注射器将样品处理液均匀喷洒在1.7cm宽度的样品垫上，取出后将其烘置于37℃烘箱内烘干8小时；

(4)试纸条的组装及切割：将塑料底板、包被膜、吸水垫、标记垫和样品垫按顺序依次粘贴后，用切条机将其切成试纸条，装入模具中；上述操作在湿度小于40％，温度12-26℃的环境下进行。

(5)缓冲液2的配制：配制含有0.01m磷酸氢二钠及0.01m氯化钠，ph为7.3的纯化水溶液。

二、试剂盒加样方式：

使用前将检测试剂、样本恢复至室温(20-30℃)。从铝箔袋中取出检测试剂，将检测试剂放置在干净的水平台面上。

血清/血浆：用吸管3垂直滴入1滴样本(约40μl)于加样孔(s)中，滴加一滴缓冲液2，同时开始计时。

静脉血：用吸管3垂直滴入2滴样本(约80μl)于试剂加样孔(s)中，滴加一滴缓冲液2，同时开始计时。

指尖血：用吸管3滴加2滴指尖血(约80μl)于试剂加样孔(s)中，滴加一滴缓冲液2，同时开始计时。

滴加完后等待紫红色条带出现，测试结果应在10-20分钟读取，20分钟后读取的结果无效。

三、试剂盒检测结果判定

阳性(+)：检测线位置(t)有一条与参考线(r)强度相等或相近的条带出现，表明样品中含有ca15-3的浓度约为30iu/ml。检测线位置(t)有一条比参考线(r)强的条带出现，表明样品中含有ca15-3的浓度高于30iu/ml。

阴性(-)：质控区(c)和参考区(r)均有一条紫色条带出现。检测区(t)有一条比参考线(r)弱的条带出现，表明样品中含有ca15-3的浓度在5～30iu/ml之间。检测区(t)没有紫色条带出现，表明样品中含有ca15-3的浓度在5iu/ml以下。

无效：若质控区(c)或参考区(r)有一个区域或两个区域均没有紫色条带出现，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。

四、试剂盒灵敏度试验

采用ca15-3标准品配制不同浓度的溶液，具体如下：

采用实施例1制备的试剂盒测试标准品浓进行测定，通过颜色卡判读浓度结果，每个浓度测定3次。结果表明，实施例1制备的试剂盒的灵敏度为5iu/ml。五、试剂盒特异性试验

与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率＜0.01％。

六、试剂盒精密度试验

(1)批内变异：取低、中、高三份质控血清样品分别进行10个平行实验，计算期批内变异系数(cv％)，得出批内差异cv在3.2-5.0之间。

(2)批间变异：选择5份不同浓度的血清样本对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数(cv％)，得出批间变异cv在8.95～10之间。

七、试剂盒稳定性试验

考虑到运输和使用过程对试剂盒的影响，本实施例对试剂盒进行55℃下35天的加速试验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。

以上实验说明本实施例的试剂盒可半定量检测全血、血清、血浆中ca15-3。

实施例2

制备工艺步骤同实施例1，配方调整如下：

步骤(1)，配制0.015m，ph7.4的磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液；

步骤(2)，利用柠檬酸钠还原氯金酸分别制备粒径为30nm的ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg的胶体金溶液；

步骤(3)，配制含有1.2％三羟甲基氨基甲烷、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％表面活性剂s9、3％鼠抗人红细胞单克隆抗体以及0.07％酪蛋白的ph为8.0的纯化水溶液作为样品垫处理液；

步骤(5)，配制含有0.05m磷酸氢二钠及0.1m氯化钠，ph为7.4的纯化水溶液。

采用同实施例1的方法进行试剂盒灵敏度试验、试剂盒特异性试验、试剂盒精密度试验、试剂盒稳定性试验，得出本实施例的试剂盒的灵敏度为5iu/ml，交叉反应率＜0.01％，批内差异cv为3.2-5.0，批间变异cv为8.95～10，各项指标完全符合要求，可半定量检测全血、血清、血浆中ca15-3。

实施例3

制备工艺步骤同实施例1，配方调整如下：

步骤(1)，配制0.015m，ph7.5的磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液；

步骤(2)，利用柠檬酸钠还原氯金酸分别制备粒径为40nm的ca15-3单克隆抗体1、兔igg和鼠igg的胶体金溶液；

步骤(3)，配制含有1.5％三羟甲基氨基甲烷、1％聚乙烯吡咯烷酮、1％表面活性剂s9、5％鼠抗人红细胞单克隆抗体以及0.1％酪蛋白的ph为8.5的纯化水溶液作为样品垫处理液；

步骤(5)，配制含有0.1m磷酸氢二钠及0.2m氯化钠，ph为7.5的纯化水溶液。

采用同实施例1的方法进行试剂盒灵敏度试验、试剂盒特异性试验、试剂盒精密度试验、试剂盒稳定性试验，得出本实施例的试剂盒的灵敏度为5iu/ml，交叉反应率＜0.01％，批内差异cv为3.2-5.0，批间变异cv为8.95～10，各项指标完全符合要求，可半定量检测全血、血清、血浆中ca15-3。