一种高通量检测柚皮素的方法与流程

本发明涉及一种高通量检测柚皮素的方法，属于生物化学领域。

背景技术：

黄酮类化合物具有广泛的功能，如抗炎症、抗衰老、抗癌、保肝护肝、调节人体激素水平和抗氧化等功能，已经被广泛的作为食品和药品的有效成分。黄酮类化合物是一类具有三个碳原子连接两个苯环所构成的复杂化合物，所以黄酮类化合物都具有一个共同的核心骨架，其不同之处在于核心骨架上连接的化学基团不同。柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，独特的空间结构使得其成为了具有最多衍生物的黄酮骨架类物质。经过对柚皮素的后续化学或酶法催化修饰，适当的羟基化、甲基化、糖基化等催化反应，即可生成具有更高附加值和功能多样的黄酮类化合物。

目前柚皮素生产的国际研究主要包括化学合成法、植物组织提取法和微生物合成法三种。然而由于化学反应极为复杂，反应条件剧烈，难以应用于食品和药品领域，具有生物活性的黄酮类化合物往往与其手性结构密切相关，因此化学合成方法难以实现廉价的大规模工业化生产。目前柚皮素的工业生产方法主要以橘子皮提取为主，然而，相比较于微生物法生产，提取同样法面临众多挑战：受季节限制严重，提取物来源不同可能存在重金属污染和农药残留，需要占用大量耕地，橘子皮中柚皮素含量低、杂质多等因素均导致柚皮素产量不高同时价格昂贵。

近年来代谢工程和合成生物学的迅猛发展为微生物法高效生产柚皮素等黄酮类化合物提供了可能。然而微生物法生产柚皮素在目前的研究中依然面临诸多挑战。首先，筛选高效柚皮素等黄酮类化合物生产菌株和途径基因需要建立一套高通量检测方法。其次，植物来源的黄酮类化合物合成基因在微生物中表达往往无法实现高活性表达，因此利用随机突变高通量筛选策略筛选高活性基因迫在眉睫。然而，目前柚皮素等黄酮类化合物发酵产物检测主要依赖于前处理过程复杂、耗时严重的高效液相色谱(hplc)检测方法。通过添加金属离子检测黄酮类化合物的光谱法检测方法普遍应用于检测植物提取物中的总黄酮含量，其检测环境较为纯净，在发酵液等复杂的检测体系中易受干扰，且针对柚皮素单一黄酮类化合物的最佳检测条件、检测金属离子和光谱学性质并无详细报道。目前缺少一套简单、快捷和抗干扰能力强的柚皮素等黄酮类化合物高通量检测方法用于发酵产品检测，这大大的限制了针对黄酮类化合物生产菌株的高通量改造实验的可行性。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种通过添加铝离子或镁离子作为助色基团检测柚皮素的方法。

所述检测柚皮素的方法，是向待测样品中，添加铝离子，然后测定荧光强度或者在紫外光下检测吸收强度；或者，添加镁离子，然后测定荧光强度；对照标准曲线，确定待测样品中柚皮素的含量。

所述待测样品，是生物法合成柚皮素得到的样品。包括以微生物发酵制备柚皮素时，得到的发酵上清液。

所述以微生物发酵制备柚皮素，包括以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以葡萄糖、或l-酪氨酸或者对香豆酸为底物发酵制备柚皮素。

所述以微生物发酵制备柚皮素，包括以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以mops或m9培养基为发酵培养基。

所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以alcl3为助色基团针对采用mops培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长382nm、发射光波长505nm条件下，测定荧光强度。

所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以alcl3为助色基团针对采用m9培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长374nm、发射光波长505nm条件下，测定荧光强度。

所述添加铝离子，然后在紫外光下检测吸收强度，是以alcl3为助色基团针对采用mops培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于紫外检测波长为330～430nm范围内，例如373nm处检测吸收强度。

所述添加镁离子，然后测定荧光强度，以mgoac为助色基团针对采用mops培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长371nm、发射光波长492nm条件下，测定荧光强度。

所述alcl3在待测样品中的质量浓度为0.5～3％，优选2％。

所述mgoac在待测样品中的质量浓度为0.5～3％，优选1％。

在本发明的一种实施方式中，荧光信号可利用多功能酶标仪、紫外-可见光分光光度计和流式细胞仪等可检测荧光信号或紫外吸收信号的仪器检测。

在本发明的一种实施方式中，mgoac和alcl3等含有mg²⁺和al³⁺的助色基团可溶解于水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜或上述的混合溶剂中，然后添加到待测样品中。

在本发明的一种实施方式中，应用此方法检测的柚皮素可以作为黄酮类化合物生产过程中的中间代谢产物。

本发明的有益之处：提供了一种简单快捷的柚皮素等黄酮类化合物检测方法，此方法利用了常见的无毒化学物质mgoac和alcl3等含有金属mg²⁺和al³⁺的化合物作为助色基团，mg²⁺和al³⁺离子与柚皮素等黄酮类化合物结合而生成一种络合物，此络合物可受激发光激发而产生荧光，此外其紫外-可见光吸收光谱亦会产生相应的变化，且荧光强度和紫外吸收强度与柚皮素等黄酮类化合物含量呈正比。此方法是首次建立的针对微生物发酵生产黄酮类化合物的高通量检测方法，为黄酮类化合物的微生物法生产提供了一个快速高效的检测方法。柚皮素等黄酮类化合物合成相关的酶学性质研究同样可采用此方法。与传统的高效液相色谱(hplc)检测方法相比较，本方法最大的优势是检测效率高，无需样品前处理过程，可实现在多孔板中的高通量检测。基于此检测方法，未来诱变技术，随机突变方法以及其他的高通量改造策略均可应用于对柚皮素等黄酮类化合物微生物法生产。此方法为高通量改造微生物生产柚皮素等黄酮类化合物扫清了障碍。

附图说明

图1柚皮素、对香豆酸、l-酪氨酸的紫外-可见光光谱学特性。a-c：紫外-可见光光谱扫描在水溶液(a)、m9溶液(b)中和mops溶液(c)中的柚皮素、对香豆酸、l-酪氨酸。

图2柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸的激发光光谱。a-e：在水(a)、1％alcl3-mops溶液(b)、1％alcl3-m9溶液(c)、1％mgoac-mops溶液(d)、1％mgoac-m9溶液(e)中的柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸荧光激发光谱。

图3柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸的发射光光谱。a-e：在水(a)、1％alcl3-mops溶液(b)、1％alcl3-m9溶液(c)、1％mgoac-mops溶液(d)、1％mgoac-m9溶液(e)中的柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸荧光发射光谱。

图4alcl3、mgoac和h3bo3作为助色基团时的柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸紫外-可见光全波长扫描光谱。a-c：在水中(a)、m9溶液(b)中和mops溶液(c)中以alcl3作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸的全波长扫描图谱；d-f：在水中(d)、m9溶液(e)中和mops溶液(f)中以mgoac作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸的全波长扫描图谱；g-i：在水中(g)、m9溶液(h)中和mops溶液(i)中以h3bo3作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸的全波长扫描图谱。

图5混合交叉实验。a：在2％alcl3-mops溶液中382nm，激发505nm发射荧光检测柚皮素；b：在2％alcl3-m9溶液中374nm，激发505nm发射荧光检测柚皮素；c：在1％mgoac-mops溶液中371nm，激发492nm发射荧光检测柚皮素；d：在2％alcl3-mops溶液中373nm紫外检测柚皮素；实线代表hplc测定结果，虚线代表荧光检测结果。

图6柚皮素高通量检测流程图。反应液为alcl3溶液或mgoac溶液等体积与发酵液混合后至于多功能酶标仪检测。

具体实施方式

材料与方法

野生型e.colibl21(de3)，alcl3，mgoac，对香豆酸，l-酪氨酸，n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，丙二酸钠，二甲基亚砜，mops均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。黑色荧光96潜孔板，紫外可透平底96浅孔板购自康宁公司。多功能酶标仪cytation3platereader(biotek)用于检测样品荧光强度和紫外吸收强度。

mops培养基(/l)：10×mops母液100ml，0.132molk2hpo410ml，5g葡萄糖，4g氯化铵，无菌蒸馏水890ml。

10×mops母液(/l)：1molmops(potassiummorpholinopropanesulfonate)溶液400ml，用koh调ph至7.4；1moltricine(n-tris(hydroxymethyl)-methylglycine)40ml，用koh调ph至7.4；0.01molfeso410ml；1.90molnh4cl50ml；0.276molk2so410ml；5.0×10^-4molcacl210ml；0.528molmgcl210ml；5.0molnacl100ml；微量元素(3×10^-6mol(nh4)6(mo7)24，4×10^-4molh3bo2，3×10^-5molcocl2，10^-5molcuso4，8×10^-5molmncl2，10^-5molznso4)10ml，无菌蒸馏水360ml。

m9培养基成分：葡萄糖(4g/l)，na2po4·7h2o(12.8g/l)，kh2po4(3g/l)，nacl(0.5g/l)，nh4cl(1g/l)，mgso4·7h2o(0.492g/l)，cacl2·6h2o(0.02191g/l)。

附图说明以及以下实施例中涉及的m9溶液、mops溶液是指分别利用m9基本培养基、mops培养基，在37℃、220rpm条件下培养野生型的大肠杆菌bl21(de3)48h，1200rpm离心5min，取上清液作为溶剂，配制的alcl3溶液或mgoac溶液。

实施例1光谱学性质分析

首先以二甲基亚砜(dmso)为溶剂配制200mg/l的柚皮素，200mg/l的对香豆酸，50mg/l的l-酪氨酸。将配制好的样品置于多功能酶标仪cytation3platereader(biotek)进行230～999nm全波长扫描、激发光光谱扫描和发射光光谱扫描。结果显示三种物质的紫外吸收峰具有大面积重叠(图1a)，而只具有微弱的荧光信号产生(图2a、3a)。即在不添加金属离子助色基团时柚皮素、对香豆酸和l-酪氨酸是无法产生荧光信号的，且在不添加金属离子助色基团以偏移柚皮素最大吸收峰的情况下是无法通过紫外检测来定量柚皮素含量的。

实施例2以alcl3为助色基团荧光检测柚皮素

利用代谢工程和合成生物学手段改造的工程菌株在发酵过程中所产生的柚皮素等黄酮类化合物往往混合在发酵液中，发酵液中同时还存有培养基成分、菌体生长代谢副产物、中间代谢产物、蛋白质和细胞碎片等大量杂质。由于发酵体系成分的复杂性，利用光谱法检测产物往往面临检测干扰严重等问题。

分别利用mops培养基、m9基本培养基在37℃、220rpm条件下培养野生型的大肠杆菌bl21(de3)48h，1200rpm离心5min，取上清液作为溶剂，配制质量分数为2％的alcl3溶液，再分别添加200mg/l柚皮素、200mg/l对香豆酸、50mg/ll-酪氨酸，以alcl3为助色基团分别用于对上述3种物质的检测。

随后，利用多功能酶标仪进行激发光谱扫描和发射光谱扫描，扫描结果显示：

(1)对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，alcl3作为助色基团时只有柚皮素在激发光382nm，发射光505nm处产生荧光，同时由发酵培养基上清、对香豆酸和l-酪氨酸所产生的荧光背景值很低，低于柚皮素响应信号的10％(图2b、3b)，由此可知，以alcl3作为助色基团，对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，具有定量检测柚皮素在发酵液中含量的能力。

(2)对于以m9作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，alcl3作为助色基团时，柚皮素可在激发光374nm，发射光505nm处现荧光，同时由发酵培养基上清、对香豆酸和l-酪氨酸所产生的荧光背景值很低，低于柚皮素响应信号的10％(图2c、3c)，由此可知，以alcl3作为助色基团，对于以m9培养基作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，具有定量检测柚皮素在发酵液中含量的能力。

实施例3以mgoac为助色基团荧光检测柚皮素

分别利用mops培养基、m9基本培养基在37℃、220rpm条件下培养野生型的大肠杆菌bl21(de3)48h，随后将发酵液12000rpm离心5min，取上清液作为溶剂，配制质量分数为2％的mgoac溶液，再分别添加200mg/l柚皮素、200mg/l对香豆酸、50mg/ll-酪氨酸，以mgoac为助色基团分别用于对上述3种物质的检测。

随后，利用多功能酶标仪进行激发光谱扫描和发射光谱扫描，扫描结果显示：

(1)对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，mgoac作为助色基团时，只有柚皮素在激发光371nm，发射光492nm处产生荧光，同时由发酵培养基上清、对香豆酸和l-酪氨酸所产生的荧光背景值很低，低于柚皮素响应信号的10％(图2d、3d)，由此可知，以mgoac作为助色基团，对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，具有可定量检测柚皮素在发酵液中含量的能力。

(2)对于以m9作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，利用mgoac作为助色基团时，检测柚皮素背景信号强烈，无法直接检测出柚皮素在体系中的含量(图2e、3e)。因此，对于以m9培养基作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，以mgoac作为助色基团无法实现定量检测。

实施例4以alcl3为助色基团紫外检测柚皮素

利用mops培养基在37℃、220rpm条件下培养野生型的大肠杆菌bl21(de3)48h，随后将发酵液12000rpm离心5min，取上清液作为溶剂，配制质量分数为2％的alcl3、mgoac和nabh4溶液，再分别添加200mg/l柚皮素、200mg/l对香豆酸、50mg/ll-酪氨酸，以alcl3为助色基团分别用于对上述3种物质的检测。

利用多功能酶标仪对上述反应体系进行230～999nm范围内的全波长扫描，扫描结果显示，对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，alcl3、mgoac和nabh4作为助色基团时，柚皮素、对香豆酸、l-酪氨酸在290nm处均有强烈的吸收(图4)；然而，当以alcl3作为助色基团时柚皮素在373nm处形成了一个全新的吸收峰，且在373nm处对香豆酸和l-酪氨酸并没有强烈的紫外吸收(图4g、i)。由此可知，以alcl3作为助色基团，对于以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清体系，在373nm处具有定量检测柚皮素在发酵液中含量的能力。

实施例5助色基团浓度对紫外-荧光检测的影响

不同浓度的alcl3和mgoac浓度在检测过程中可能会有不同强度的荧光信号响应。为了找到最佳的alcl3和mgoac检测浓度，分别以mops和m9培养基发酵培养野生型e.colibl21(de3)得到的上清液配制浓度分别为1％、2％、4％和6％的alcl3和mgoac溶液用于检测柚皮素。分别以dmso为溶剂配制浓度为10，20，30，40和50mg/l的柚皮素标准溶液。将柚皮素标准溶液分别与浓度为1％，2％，4％和6％的alcl3和mgoac溶液等体积混合，随后于多功能酶标仪检测荧光强度和紫外吸收强度，制作标准曲线。以标准曲线r²为评定标准，配制体系与测定结果如表1：

表1alcl3和mgoac浓度优化体系

备注：*表示柚皮素荧光检测方法优化体系；**表示柚皮素紫外检测方法优化体系。

测定结果显示：

(1)以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清作为溶剂，配制2％alcl3作为助色基团，荧光检测柚皮素时，得到的标准曲线的r²＝0.9994；以m9作为发酵培养基得到的发酵液上清作为溶剂，配制2％alcl3作为助色基团，荧光检测柚皮素时，得到的标准曲线的r²＝0.9999；

(2)以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清作为溶剂，配制1％mgoac作为助色基团，荧光检测柚皮素时，得到的标准曲线的r²＝0.9999；

(3)以mops作为发酵培养基得到的发酵液上清作为溶剂，配制2％alcl3作为助色基团，紫外检测柚皮素时，得到的标准曲线的r²＝0.9991。

实施例6hplc与本发明方法的比较

hplc检测条件为：gemininx-c18column(4.6×250mm)色谱柱，流动相为乙腈和0.3％乙酸溶液，290nm紫外检测。检测条件为：1.0ml/min流速，0～10min时间内10～40％乙腈梯度洗脱，10～15min时间内40％乙腈洗脱，15～20min时间内40～10％梯度洗脱。

由于在真实的发酵体系中，需检测的目标化合物往往与中间代谢产物和培养基混合在一起，混合的检测体系可能会对检测的准确性造成干扰。为验证混合体系对柚皮素的荧光检测法和紫外检测法造成的干扰程度，实验将柚皮素合成的中间代谢产物l-酪氨酸和对香豆酸与柚皮素以及以mops或m9培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液按照不同的比例混合，从而配制出不同的混合体系，分别利用本发明和常用的hplc检测方法进行检测。混合体系中的各成分含量见表2，检测结果见图5：

表2混合体系各成分比例

备注：*柚皮素/对香豆酸/l-酪氨酸在混合体系中的浓度；a：以alcl3作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中荧光法检测柚皮素含量；b：以alcl3作为助色基团，在以m9培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中荧光法检测柚皮素含量；c：以mgoac作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中荧光法检测柚皮素含量；d：以alcl3作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中紫外法检测柚皮素含量。

(1)以2％的alcl3作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中以382nm激发、505nm发射光检测柚皮素，设定l-酪氨酸含量为50mg/l时，柚皮素、对香豆酸含量逐渐增加，结果显示与hplc检测结果具有高度的吻合性(图5a)，误差±10％。

(2)同样的，以2％的alcl3作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中以374nm激发、505nm发射光检测柚皮素，设定l-酪氨酸含量为50mg/l，柚皮素、对香豆酸含量逐渐增加，结果显示与hplc检测结果具有高度的吻合性(误差±10％)(图5b)。

(3)以1％的mgoac作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中以371nm激发、492nm发射光检测柚皮素，设定l-酪氨酸含量为50mg/l，柚皮素、对香豆酸含量逐渐增加，结果显示与hplc检测结果具有高度的吻合性(误差±10％)(图5c)。

(4)以2％的alcl3作为助色基团，在以mops培养基发酵培养e.colibl21(de3)得到的上清液中以373nm紫外吸收检测柚皮素，当l-酪氨酸含量为50mg/l，柚皮素、对香豆酸含量逐渐增加时，结果显示与hplc检测结果具有高度的吻合性(误差±10％)(图5d)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。