本发明涉及一种美洛西林酸的质量指标检测方法。
背景技术：
：美洛西林钠是一种高效苯咪唑青霉素类抗生素，从胃肠道吸收困难，常用其钠盐供肠道外给药。本品抗菌作用类似于羧苄青霉素，但其作用范围更广，抗菌谱也较天然青霉素广泛。但是有下列不良影响：⒈血液学影响：少数患者用药后可引起白细胞总数减少、血小板减少、嗜酸粒细胞增多。2.心血管系统的影响：少数患者静脉给药时偶可出现血栓性静脉炎。⒊中枢神经系统的影响：有报道美洛西林对中枢神经系统的潜在毒性为惊厥和神经肌肉应激性过高。这些毒性反应在肾功能下降的老年患者中尤易出现。偶见用药时导致癫痫发作的报道。⒋内分泌/代谢系统的影响：偶有使用美洛西林治疗时出现低钾血症的报道，尤见于癌症患者用药中。⒌胃肠道的影响：使用美洛西林治疗后，少数患者可出现食欲减退、腹泻等消化道症状。⒍肾脏/泌尿生殖系统的影响：有报道在美洛西林治疗中，患者偶见出现间质性肾炎。⒎肝脏的影响：有报道在美洛西林治疗中，患者可发生肝功能异常。出现血清转氨酶(天门冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶)升高。⒏皮肤的影响：有报道在美洛西林治疗期间，少数患者可出现多种皮肤反应，如全身性皮疹、发热、荨麻疹、瘙痒等。技术实现要素：本发明提供一种美洛西林酸，其特征在于，其化学名：(2s,5r,6r)-3,3-二甲基-6-[(r)-2-{3-(甲磺酰-2-氧代-1-咪唑烷碳酰胺)-2-苯乙酰胺基}-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3,2,0]-庚烷-2-羧酸；结构式：分子式：c21h25n5o8s2相对分子质量：539.6。本发明还提供一种美洛西林酸的质量指标检测方法，包括如下步骤：(1)抽样；(2)用目测法检验外观；(3)用液相色谱法进行含量测定；(4)水分测定；(5)比旋度测定；(6)检测溶液的澄清度与颜色；(7)有关物质测定；(8)细菌内毒素检查；(9)细度检测；(10)聚合物测定；(11)残留溶剂乙醇、乙酸乙酯测定。具体步骤如下：(1)抽样当每批产品总件数n≤300时抽取n0.5+1件；总件数n≥300时，抽取n0.5/2+1件。取样量为六倍的检验量。把抽取样品混合均匀，迅速分成两份，分装于清洁干燥的具塞瓶(样品袋)中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期，一份供产品检测用，另一份在样品室中密封保存备查。(2)外观用目测法检验待测物品的色泽为白色或类白色粉末。(3)含量测定(液相色谱法)色谱柱vp-odsc18、gbdc18酸150mm×4.6mm波长：210nm柱温：30℃流动相：磷酸盐缓冲液：乙腈＝80:20，(磷酸盐缓冲液：取无水磷酸二氢钾4.9g和无水磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)速度：2ml/min供试品：精密称定，加流动相溶解制成每1ml中含美洛西林酸1mg的溶液。精密量取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取美洛西林酸对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品的含量。(4)水分测定用水分测定仪测定；打开机器，先将系统中的水分预滴定除去，精密称取纯化水10～30mg，用水分测定仪直接标定。精密称取供试品适量，除另外规定外，溶剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定。(5)比旋度测定。精密称定样品，加ph7.8～8.0的磷酸盐缓冲液(取无水磷酸氢二钾5.59g和磷酸二氢钾0.41g，加水溶解并稀释至1000ml)溶解，制成每1ml中含美洛西林酸10mg的溶液，将测定管用测试液冲洗数次，置于旋光仪内检测读数，即得测试液的旋光度，用同法读取旋光度3次，取3次的平均值，即得测试品的比旋度，依按下列公式计算：(6)溶液的澄清度与颜色称取样品2.0g，加1.6％碳酸氢钠溶液20ml溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓。本标准规定的“澄明”，系指供试品溶液的澄清度与所用溶剂相同，或不超过0.5号浊度标准的浊度。浊度标准贮备液的制备称取于105℃干燥至恒重的硫酸肼1.00g,置100ml量瓶中，加水适量使溶解，必要时可在40℃的水浴中温热溶解，并用水稀释至刻度摇匀，放置4～6小时；取此溶液与等容量的10％乌洛托品溶液混合摇匀，于25℃避光静置24小时，即得。该溶液置冷处避光保存，可在2个月内使用，用前摇匀。浊度标准溶液的制备取浊度标准贮备液15.0ml置1000ml量瓶中，加水稀释置刻度摇匀，取适量置1cm吸收池中，照紫外-可见分光光度法，在550nm的波长处测定，其吸光度应在0.12～0.15范围内。该溶液应在48小时内使用。用前摇匀。浊度标准液的制备取浊度标准原液与水，按下表配制，即得。浊度标准溶液应临用时制备，使用前充分摇匀。级号0.51234浊度标准原液/ml2.505.010.3050水/ml97.5095.090.070.050.0(7)有关物质测定精密称取样品适量，加流动相溶解并制成每1ml中含美洛西林酸2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加水稀释成每1ml含美洛西林酸20μg的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的色谱条件进行试验，取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为满量程的10％～15％，再取上述两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4倍。供试品溶液如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰的峰面积的0.3倍(0.3％)，各杂质的峰面积总和不得大于对照溶液主峰的峰面积的0.8倍(0.8％)。(8)细菌内毒素检查精密称取0.5g样品于10ml无热源容量瓶中，加适量0.5mol/l氢氧化钠溶液溶解后用检查用水稀释，调节溶液ph值为6.5，制成10ml美洛西林钠溶液，每1mg美洛西林酸中含内毒素的量应小于0.06eu。检查操作本实验使用0.125eu/ml规格的鲎试剂。取鲎试剂8支，折断安瓿瓶，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水；每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素的供试品。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵欲60±2分钟，然后取出观察结果。试管在孵育期间应避免任何的振动。结果判断将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不结实、变形并从壁管滑脱者为阴性，记录为(-)。保温和拿取试管应避免受到振动造成假阴性结果。阴性对照管必须是阴性，阳性对照管、供试品对照管必须是阳性，否则实验结果无效。若阴性对照管是阳性，表明鲎试剂或检查用水或试验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准确，或实验条件不满足；供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。(9)细度检测称取样品适量(准确至0.1g)，用60目分样筛进行过筛，通过部分产品的质量分数应不小于85％。(10)聚合物测定色谱柱：葡聚糖凝胶柱g10(40～120μm)300mm×10mm流速：1.5ml/min波长：254nm柱温：室温流动相a：ph8.0的0.05mol/l磷酸盐缓冲液[0.05mol/l磷酸二氢钠——0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(95：5)]流动相b：水精密称取美洛西林酸适量，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解澄明后，用水定量稀释制成每1ml中含0.3mg溶液，作为对照品溶液。精密称取0.3g样品，置10ml容量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解澄明后，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μl进样，以流动相a为流动相依法测定(中国药典2015版四部通则0514——分子排阻色谱法)。另精密量取对照品溶液20μl进样，以流动相b为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含美洛西林酸聚合物以美洛西林酸计，不得过0.08％。(11)残留溶剂乙醇、乙酸乙酯测定精密称取样品100mg，置于20ml顶空瓶中，精密量取2ml0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解，密封瓶口，作为供试品溶液。精密量取乙醇30μl，乙酸乙酯28μl，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，作为对照品溶液。照中国药典2015版四部通则0861——残留溶剂测定法第一法测定，以6％氰丙基苯—94％二甲基硅氧烷(或极性相似)为固定液的毛细管色谱柱，柱温为100℃，检测器为氢火焰离子化检测器(fid)，检测器温度为250℃；进样口温度为200℃；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30分钟，进样体积为1ml。精密量取对照品溶液与供试品溶液，分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含乙醇不得过0.5％，含乙酸乙酯不得过0.5％。美洛西林酸是一种十分重要的医药中间体，主要用于新型青霉素的合成，是第三代青霉素美洛西林的基础原料。本发明参照药典中美洛西林钠的要求及国内有关药厂反馈的数据，结合实际情况而制定，使用安全。本发明产品对血液学影响：未发现引起白细胞总数减少、血小板减少、嗜酸粒细胞增多。对心血管系统的影响：未发现患者静脉给药时偶可出现血栓性静脉炎。胃肠道的影响：使用美洛西林酸治疗后，未发现患者可出现食欲减退、腹泻等消化道症状。皮肤的影响：未发现患者出现皮肤反应，如全身性皮疹、发热、荨麻疹、瘙痒等。具体实施方式本发明提供一种美洛西林酸，其特征在于，其化学名：(2s,5r,6r)-3,3-二甲基-6-[(r)-2-{3-(甲磺酰-2-氧代-1-咪唑烷碳酰胺)-2-苯乙酰胺基}-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3,2,0]-庚烷-2-羧酸；结构式：分子式：c21h25n5o8s2相对分子质量：539.6。本发明美洛西林酸的技术指标如表1。表1本发明还提供一种美洛西林酸的质量指标检测方法，包括如下步骤：(1)抽样；(2)用目测法检验外观；(3)用液相色谱法进行含量测定；(4)水分测定；(5)比旋度测定；(6)检测溶液的澄清度与颜色；(7)有关物质测定；(8)细菌内毒素检查；(9)细度检测；(10)聚合物测定；(11)残留溶剂乙醇、乙酸乙酯测定。具体步骤如下：(1)抽样当每批产品总件数n≤300时抽取n0.5+1件；总件数n≥300时，抽取n0.5/2+1件。取样量为六倍的检验量。把抽取样品混合均匀，迅速分成两份，分装于清洁干燥的具塞瓶(样品袋)中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期，一份供产品检测用，另一份在样品室中密封保存备查。(2)外观用目测法检验待测物品的色泽为白色或类白色粉末。(3)含量测定(液相色谱法)色谱柱vp-odsc18、gbdc18酸150mm×4.6mm波长：210nm柱温：30℃流动相：磷酸盐缓冲液：乙腈＝80:20，(磷酸盐缓冲液：取无水磷酸二氢钾4.9g和无水磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)速度：2ml/min供试品：精密称定，加流动相溶解制成每1ml中含美洛西林酸1mg的溶液。精密量取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取美洛西林酸对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品的含量。(4)水分测定用水分测定仪测定；打开机器，先将系统中的水分预滴定除去，精密称取纯化水10～30mg，用水分测定仪直接标定。精密称取供试品适量，除另外规定外，溶剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定。(5)比旋度测定。精密称定样品，加ph7.8～8.0的磷酸盐缓冲液(取无水磷酸氢二钾5.59g和磷酸二氢钾0.41g，加水溶解并稀释至1000ml)溶解，制成每1ml中含美洛西林酸10mg的溶液，将测定管用测试液冲洗数次，置于旋光仪内检测读数，即得测试液的旋光度，用同法读取旋光度3次，取3次的平均值，即得测试品的比旋度，依按下列公式计算：(6)溶液的澄清度与颜色称取样品2.0g，加1.6％碳酸氢钠溶液20ml溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓。本标准规定的“澄明”，系指供试品溶液的澄清度与所用溶剂相同，或不超过0.5号浊度标准的浊度。浊度标准贮备液的制备称取于105℃干燥至恒重的硫酸肼1.00g,置100ml量瓶中，加水适量使溶解，必要时可在40℃的水浴中温热溶解，并用水稀释至刻度摇匀，放置4～6小时；取此溶液与等容量的10％乌洛托品溶液混合摇匀，于25℃避光静置24小时，即得。该溶液置冷处避光保存，可在2个月内使用，用前摇匀。浊度标准溶液的制备取浊度标准贮备液15.0ml置1000ml量瓶中，加水稀释置刻度摇匀，取适量置1cm吸收池中，照紫外-可见分光光度法，在550nm的波长处测定，其吸光度应在0.12～0.15范围内。该溶液应在48小时内使用。用前摇匀。浊度标准液的制备取浊度标准原液与水，按下表配制，即得。浊度标准溶液应临用时制备，使用前充分摇匀。级号0.51234浊度标准原液/ml2.505.010.3050水/ml97.5095.090.070.050.0(7)有关物质测定精密称取样品适量，加流动相溶解并制成每1ml中含美洛西林酸2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加水稀释成每1ml含美洛西林酸20μg的溶液，作为对照品溶液；照含量测定项下的色谱条件进行试验，取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分的峰高约为满量程的10％～15％，再取上述两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4倍。供试品溶液如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰的峰面积的0.3倍(0.3％)，各杂质的峰面积总和不得大于对照溶液主峰的峰面积的0.8倍(0.8％)。(8)细菌内毒素检查精密称取0.5g样品于10ml无热源容量瓶中，加适量0.5mol/l氢氧化钠溶液溶解后用检查用水稀释，调节溶液ph值为6.5，制成10ml美洛西林钠溶液，每1mg美洛西林酸中含内毒素的量应小于0.06eu。检查操作本实验使用0.125eu/ml规格的鲎试剂。取鲎试剂8支，折断安瓿瓶，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水；每支供试品检查管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素的供试品。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃的恒温器中孵欲60±2分钟，然后取出观察结果。试管在孵育期间应避免任何的振动。结果判断将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不结实、变形并从壁管滑脱者为阴性，记录为(-)。保温和拿取试管应避免受到振动造成假阴性结果。阴性对照管必须是阴性，阳性对照管、供试品对照管必须是阳性，否则实验结果无效。若阴性对照管是阳性，表明鲎试剂或检查用水或试验器具受到污染；若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价标示不准确，或实验条件不满足；供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应的干扰因素存在。(9)细度检测称取样品适量(准确至0.1g)，用60目分样筛进行过筛，通过部分产品的质量分数应不小于85％。(10)聚合物测定色谱柱：葡聚糖凝胶柱g10(40～120μm)300mm×10mm流速：1.5ml/min波长：254nm柱温：室温流动相a：ph8.0的0.05mol/l磷酸盐缓冲液[0.05mol/l磷酸二氢钠——0.05mol/l磷酸氢二钠溶液(95：5)]流动相b：水精密称取美洛西林酸适量，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解澄明后，加水定量稀释制成每1ml中含0.3mg溶液，作为对照品溶液。精密称取0.3g样品，置10ml容量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解澄明后，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μl进样，以流动相a为流动相依法测定(中国药典2015版四部通则0514——分子排阻色谱法)。另精密量取对照品溶液20μl进样，以流动相b为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含美洛西林酸聚合物以美洛西林酸计，不得过0.08％。(11)残留溶剂乙醇、乙酸乙酯测定精密称取样品100mg，置于20ml顶空瓶中，精密量取2ml0.5mol/l碳酸氢钠溶液溶解，密封瓶口，作为供试品溶液。精密量取乙醇31μl，乙酸乙酯28μl，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，作为对照品溶液。照中国药典2015版四部通则0861——残留溶剂测定法第一法测定，以稀释制成每1ml中含0.3mg溶液，作为对照品溶液。以6％氰丙基苯—94％二甲基硅氧烷(或极性相似)为固定液的毛细管色谱柱，柱温为100℃，检测器为氢火焰离子化检测器(fid)，检测器温度为250℃；进样口温度为200℃；顶空进样，顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30分钟，进样体积为1ml。精密量取对照品溶液与供试品溶液，分别顶空进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含乙醇不得过0.5％，含乙酸乙酯不得过0.5％。美洛西林酸是一种十分重要的医药中间体，主要用于新型青霉素的合成，是第三代青霉素美洛西林的基础原料。本发明国内有关药厂反馈的数据，结合实际情况而发明制定。本发明方法得到的数据见表1。表一当前第1页12