一种检测核酸外切酶I的荧光传感方法与流程

本发明涉及荧光生物传感器，尤其是涉及一种检测核酸外切酶i(exoi)的荧光传感方法。

背景技术：

核酸外切酶(exonucleases)是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。核酸外切酶分为：核酸外切酶i(exoi)和核酸外切酶iii(exoiii)。exoi是一种仅能从单链dna(ssdna)的3’端到5’端，按照碱基顺序，逐个催化水解碱基间的磷酸二酯键，逐渐降解ssdna的酶。exoi水解ssdna后，最终产物是逐个脱氧核糖核苷酸。exoi对ssdna的碱基序列是没有要求的，不具有水解双链dna的能力。核酸外切酶在生物学的很多过程中起着重要的作用，如dna复制、重组、修复等。其中最重要的功能就是维持生物体内的基因突变几率，从而维持遗传信息的稳定性。近年来，相继报道了exoiii的定量检测，然而exoi的研究还很少。

目前对exoi的活性检测普遍缺乏定量描述，因为传统检测exoi活性的方法是将标准的dna与核酸外切酶反应，凝胶电泳观察酶切效果，这种方法最多给出半定量结果，而且操作麻烦、重现性差，更不能实时给出不同条件下的酶活性变化。因此，发展一种快速、准确、灵敏的定量检测exoi活性的方法，将有重要价值。

铱配合物具有发光效率高、较大的stokes位移、发光颜色可以通过改变配体结构进行调节以及良好的光稳定性等优点而成为研究的热点。根据报道，铱配合物在生物传感器方面的应用越来越广泛。阳离子共轭聚合物(ccp)作为一种新型的水溶性荧光分子，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点。同时，共轭聚合物具有分子导线的功能，能够实现荧光信号的放大。铱配合物和ccp可以发生荧光共振能量转移(fret)现象。

本发明基于铱配合物和ccp的fret现象，构建一种简单、高灵敏、快速的分析传感方法，用于定量检测exoi，过程及其简单，为临床应用提供了一种很有前景的检测手段。目前，基于铱配合物和ccp的fret现象检测exoi活性的荧光传感器尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠的检测exoi的荧光传感方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测exoi的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将85～95μl浓度为3～4μmccp与0.5～2μl浓度为0.5～2mm铱配合物混合，然后加入相应体积的10×exoi缓冲液，得到100μl用于检测exoi的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(2)加入1～3μl5～15μm的ssdna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(3)不同浓度的exoi加入到步骤(2)中，然后加入相应体积的10×exoi缓冲液，30～40℃下温育25～35min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的exoi对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与exoi浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中exoi的活性。

利用上述基于铱配合物和ccp的荧光生物传感器检测exoi的方法，进行荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，检测ccp/ssdna/铱配合物体系对不同活性的exoi的检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度(i415)与铱配合物(530nm)的荧光强度比值(i530)。

发明原理：本发明基于ssdna干扰ccp与铱配合物之间的fret发展了一种无标记、简单便利的传感器用于检测exoi的活性。由于ccp带正电，与带有负电的铱配合物之间通过静电作用发生fret，加入ssdna时，二者的荧光强度比值减少；当有exoi存在时，由于exoi水解ssdna，使得二者的荧光强度比值增大。exoi浓度越大，二者的荧光强度比值i530/i415越大，荧光强度比值与exoi浓度的对数之间呈线性关系。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种检测exoi的荧光传感方法。首先，利用ssdna干扰ccp与铱配合物之间的fret。其次，exoi存在时，利用exoi水解ssdna，使得i530/i415增大。exoi浓度越大，二者的荧光强度比值i530/i415越大。实验结果表明，荧光强度比值与exoi浓度的对数之间呈线性关系，实现对exoi的检测。其优点在于：

(1)高灵敏度。在0.01-2u/ml浓度范围内，i530/i415值与exoi浓度(c)的对数之间呈现良好的线性关系，线性方程为i530/i415＝1.29+0.45×1gc(u/ml)，线性相关系数r²＝0.9926，表示曲线具有很好的拟合度，检测限为0.01u/ml。这些结果表明，该传感器对exoi的检测具有较低检测限和较高灵敏度。

(2)高特异性。核酸外切酶(exoiii)、限制内切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制内切酶(ecori)作为对照物质，均为0.1u/ml，检测均无干扰。

(3)结果准确。在10％尿液和10％血清环境中，回收率均在90％～110％之间。

(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对exoi的高灵敏检测。

综上所述，本发明是基于ssdna干扰ccp与铱配合物之间的fret构建一种无标记、简单便利的传感器用于检测exoi的活性，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度exoi的检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明传感器的可行性实验图；

图2为本发明传感器对不同浓度exoi的荧光响应图；

图3为本发明传感器对不同浓度exoi的校准曲线图；

图4为本发明传感器对exoi的选择性实验图；

图5为本发明传感器对exoi的抗干扰实验图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

实施例1

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测exoi的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将90μl浓度为3.28μmccp与1μl浓度为1mm铱配合物混合，然后加入相应体积的10×exoi缓冲液，得到100μl用于检测exoi的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(2)加入2μl10μm的ssdna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(3)不同浓度的exoi加入到步骤(2)中，然后相应体积的10×exoi缓冲液，37℃下温育30min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的exoi对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与exoi浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中exoi的活性。

实施例2

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测exoi的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将85μl浓度为4μmccp与2μl浓度为1mm铱配合物混合，然后加入相应体积的10×exoi缓冲液，得到100μl用于检测exoi的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(2)加入1μl15μm的ssdna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(3)不同浓度的exoi加入到步骤(2)中，然后相应体积的10×exoi缓冲液，34℃下温育30min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的exoi对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与exoi浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中exoi的活性。

实施例3

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测exoi的荧光传感方法，具体步骤如下：

(1)将95μl浓度为3μmccp与0.5μl浓度为2mm铱配合物混合，然后加入相应体积的10×exoi缓冲液，得到100μl用于检测exoi的基于ccp与铱配合物fret效应的荧光传感器体系。检测荧光强度，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(2)加入3μl5μm的ssdna到步骤(1)中的体系，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值。

(3)不同浓度的exoi加入到步骤(2)中，然后相应体积的10×exoi缓冲液，32℃下温育30min，检测荧光强度的变化，计算ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值，获得一系列不同浓度的exoi对应的荧光强度比值，建立荧光强度比值与exoi浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中exoi的活性。

二、可行性实验

测定ccp/铱配合物体系的荧光强度；加入66个碱基的ssdna组成ccp/ssdna/铱配合物体系，测定其荧光强度；加入exoi(10u/ml，1μl)，37℃下培养30min，测定体系的荧光强度。另外在只有ccp/铱配合物的体系中加入加入exoi(10u/ml，1μl)，作为对照实验。同时利用化学发光荧光成像系得到各溶液的荧光图像(具体实施示例1)。当体系中存在ccp和铱配合物时发生高效的fret；加入ssdna后，fret效率急剧减小；由于exoi存在时水解ssdna，530nm处的荧光强度增强，体系中的ccp和铱配合物重新发生fret(如图1)。所以我们设计的基于ccp和铱配合物fret效应的荧光传感器可以检测exoi的活性，而且可定量检测exoi的浓度，有一定的应用潜能。

三、exoi检测应用

1、利用上述具体实施例1制备的荧光生物传感器检测exoi的方法

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，检测ccp/ssdna/铱配合物体系中ccp(415nm)的荧光强度与铱配合物(530nm)的荧光强度比值i530/i415对不同浓度exoi的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中exoi的含量(具体实施示例1)。图2在530nm处的荧光强度随exoi浓度的增加而增强，这就意味着ccp与铱配合物重新发生高效的fret，因此fret效率增大。

2、灵敏度试验

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/ssdna/铱配合物体系的荧光强度比值i530/i415，exoi浓度的范围为0～2u/ml(具体实施示例1)。试验结果说明，如图3所示，说明随着exoi浓度的增大，i530/i415越明显；传感器i530/i415对exoi浓度的对数的线性相关方程为i530/i415＝1.29+0.45×igc(u/ml)，r²＝0.9926，线性范围为0.01～2.0u/ml，根据s/n计算得知，检测限为0.01u/ml。说明传感器对exoi可实现高灵敏度检测。

3、特异性实验

选择性实验与抗干扰实验如图4和5所示，其中exoi及其他酶的浓度均为0.1u/ml，所用到的其他酶如下：核酸外切酶(exoiii)、限制内切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制内切酶(ecori)。

(1)选择性实验

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/ssdna/铱配合物体系分别检测浓度为0.1u/ml的核酸外切酶(exoiii)、限制内切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制内切酶(ecori)。如图4，与exoi对比，传感器对其他酶的响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于exoi的检测有很好的选择性。

(2)抗干扰实验，

利用荧光分析，设置狭缝宽度为：10nm，激发波长是380nm，扫描电压是700v，上述具体实施例1制备的ccp/ssdna/铱配合物体系，在0.1u/ml存在下分别检测浓度为0.1u/ml的核酸外切酶(exoiii)、限制内切酶(hindiii)、核酸外切酶(λ-exo)、限制内切酶(ecori)，比较传感器对四个体系及仅exoi存在时的荧光响应，如图5，观察到i530/i415的大小与仅有exoi存在时的i530/i415基本没有差异，说明传感器实现了对exoi的特异性检测。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。