本发明涉及检测猪流行性腹泻病毒的方法，特别是一种基于重组s1蛋白检测猪流行性腹泻病毒iga抗体的elisa方法。
背景技术：
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。
作为猪的一种肠道病毒，pedv引起的免疫应答主要以肠道粘膜免疫为主。实践中，血清学检测仍然是pedv临床诊断及免疫评价的常用方法。遗憾的是，目前的抗体检测技术主要集中在血液中igg抗体水平的检测，而临床检测发现，尽管疫苗免疫后血清中存在较高水平的抗pedvigg抗体，猪群仍发生腹泻的情况时常发生。因此，传统检测血清中的pedvigg抗体水平不能真实反映pedv疫苗的免疫保护状况。对于肠道病毒来说，iga是病原体感染后肠道粘膜产生最多的抗体类型，也是阻止病原体入侵肠道的重要防线，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。因此，对于pedv来说，猪体内iga水平更能反应机体被pedv感染情况及疫苗免疫保护效力。目前对于iga的检测仍存在一定难度，国内尚缺乏标准的pedviga检测技术和产品。
技术实现要素：
本发明根据流行毒株ch/hnqx-3/14的s1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了s1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1，转化大肠杆菌bl21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组ps1蛋白，采用ni-nta亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组ps1蛋白为抗原包被酶标板，建立了pedviga抗体间接elisa检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复度，可用于pedv的临床检测及疫苗免疫评价。
本发明的目的是提供一种高通量检测pedviga抗体的elisa方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，可用于pedv的疫苗免疫评价。
本发明的技术方案是，一种基于重组s1蛋白检测猪流行性腹泻病毒iga抗体的elisa方法，它包括以下步骤：
步骤1：
重组ps1蛋白可溶性表达体系的建立
构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1，转化大肠杆菌bl21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组ps1蛋白，具体为：
(1)ps1重组表达质粒的构建
采用上游引物：5'-ggggatcctcttttgttactttgcc-3’河下游引物：5’-gcgaattcaggcgtgttgtaaagc-3’扩增ps1基因，上下游分别引入bamhi和ecori酶切位点，将该基因克隆至pet30a(+)载体，构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1；
(2)确定诱导前菌液od600值
诱导前首先测定菌液od600值，然后加入1.0mmiptg，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪sds-page电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳od600值为0.6；
(3)重组ps1蛋白诱导表达温度的优化
菌液培养至以上确定的od600值时加入1.0mmiptg，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪sds-page电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；
(4)iptg工作浓度的优化
按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mm的iptg诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪sds-page电泳观察蛋白表达情况，确定iptg的最佳诱导工作浓度为0.8mm；
(5)重组ps1蛋白诱导表达时间的优化
根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪sds-page电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；
步骤2：
重组ps1蛋白的ni-nta亲和层析纯化
(1)装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20ml填料加入柱子中，沉积30min；
(2)将镍柱接入
(3)平衡：用至少10倍柱床体积的bindbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，10mmimidazole，ph8.0)对柱子平衡2次；
(4)上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；
(5)洗涤：用washingbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，50mmimidazole，ph8.0)反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；
(6)洗脱：用elutionbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，200mmimidazole，ph8.0)洗脱目的蛋白，sds-page及western-blot鉴定分析洗脱效果；
(7)柱子保存：分别用5-10倍柱体积的bindingbuffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步骤3：
ps1-elisa方法的建立
(1)包被：表达的重组ps1蛋白按1.25μg/ml浓度用0.05mcbs(ph9.6)包被于96孔板(50μl/孔)，4℃过夜，取出后用pbst洗涤5次；
(2)封闭：每孔加入200μl的1﹪bsa作为封闭液，置于37℃条件下封闭90min，洗涤5次；
(3)加样：样品用pbs稀释后按每孔50μl加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37℃作用30min，洗涤5次；
(4)加入酶标二抗：山羊抗猪iga酶标二抗(hrp-iga)按1:4000倍稀释后，按每孔50μl量加入以上酶标孔，37℃反应30min，洗涤5次；
(5)显色与终止：按50μl/孔的量加入tmb显色液，避光条件下显色10min，加入2mh2so4终止反应，用酶标仪测定od450值；
(6)结果判定：利用以上方法检测36份pedv阴性血清，测定od450值，计算平均值
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本装置是一种基于pedv的重组纤突蛋白(s1蛋白)所建立的elisa方法。首先根据流行毒株ch/hnqx-3/14的s1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了s1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1，转化大肠杆菌bl21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组ps1蛋白，采用ni-nta亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组ps1蛋白为抗原包被酶标板，建立了pedviga抗体间接elisa检测方法。
(2)本装置检测特异性强，敏感性高。采用该elisa方法，在同批次条件下对tgev、csfv、prrsv、prv、fmdv等病毒的阳性血清进行特异性测定，同时设pedv阴性对照。结果显示，除pedv阳性血清对照外，其它血清检测结果均呈阴性，表明该方法具有较好的特异性；将3份不同iga效价的pedv阳性血清和3份pedv阳性乳汁(经商品化试剂盒筛选)从1:100开始进行倍比稀释，采用本试验所建立的elisa方法进行检测，同时设阴性对照，评价该方法的敏感性。结果显示，除3号乳汁样品外，其余样品当稀释度达到1:3200时，测得od450nm均大于0.43(临界值)，表明该方法具有较好的敏感性。
(3)本装置检测重复性好。取5份血清，用两批重组ps1蛋白包被酶联板各重复检测3次，应用spss统计学软件计算标准偏差及变异系数，对该elisa检测方法的重复性及稳定性进行统计分析。结果显示，5份样品的od450变异系数(cv)均较小，平均值为4.92﹪，表明该方法具有较好的重复性。
(4)减少投资和检测成本。使用该检测方法，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，节省检测成本，检测费用低。
(5)应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
附图说明
图1是本发明所述的pedvps1蛋白的表达、纯化及westernblot分析结果图。
m：预染蛋白marker(10-180kda)；1：未纯化的重组ps1蛋白sds-page；2-6：纯化后的重组ps1蛋白sds-page；7：westernblot显示ps1蛋白与pedv阳性血清的反应；8：空载诱导。
具体实施方式
详细描述实施例，
实施例：
步骤1：
重组ps1蛋白可溶性表达体系的建立
构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1，转化大肠杆菌bl21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组ps1蛋白，具体为：
(1)ps1重组表达质粒的构建
采用上游引物：5'-ggggatcctcttttgttactttgcc-3’河下游引物：5’-gcgaattcaggcgtgttgtaaagc-3’扩增ps1基因，上下游分别引入bamhi和ecori酶切位点，将该基因克隆至pet30a(+)载体，构建重组表达质粒pet30a(+)-ps1；
(2)确定诱导前菌液od600值
诱导前首先测定菌液od600值，然后加入1.0mmiptg，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪sds-page电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳od600值为0.6；
(3)重组ps1蛋白诱导表达温度的优化
菌液培养至以上确定的od600值时加入1.0mmiptg，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪sds-page电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；
(4)iptg工作浓度的优化
按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mm的iptg诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪sds-page电泳观察蛋白表达情况，确定iptg的最佳诱导工作浓度为0.8mm；
(5)重组ps1蛋白诱导表达时间的优化
根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪sds-page电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；
步骤2：
重组ps1蛋白的ni-nta亲和层析纯化
(1)装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20ml填料加入柱子中，沉积30min；
(2)将镍柱接入
(3)平衡：用至少10倍柱床体积的bindbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，10mmimidazole，ph8.0)对柱子平衡2次；
(4)上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；
(5)洗涤：用washingbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，50mmimidazole，ph8.0)反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；
(6)洗脱：用elutionbuffer(300mmnacl，50mmnah2po4，200mmimidazole，ph8.0)洗脱目的蛋白，sds-page及western-blot鉴定分析洗脱效果；
(7)柱子保存：分别用5-10倍柱体积的bindingbuffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步骤3：
ps1-elisa方法的建立
(1)包被：表达的重组ps1蛋白按1.25μg/ml浓度用0.05mcbs(ph9.6)包被于96孔板(50μl/孔)，4℃过夜，取出后用pbst洗涤5次；
(2)封闭：每孔加入200μl的1﹪bsa作为封闭液，置于37℃条件下封闭90min，洗涤5次；
(3)加样：样品用pbs稀释后按每孔50μl加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37℃作用30min，洗涤5次；
(4)加入酶标二抗：山羊抗猪iga酶标二抗(hrp-iga)按1:4000倍稀释后，按每孔50μl量加入以上酶标孔，37℃反应30min，洗涤5次；
(5)显色与终止：按50μl/孔的量加入tmb显色液，避光条件下显色10min，加入2mh2so4终止反应，用酶标仪测定od450值；
(6)结果判定：利用以上方法检测36份pedv阴性血清，测定od450值，计算平均值
敏感性试验
将3份不同iga效价的pedv阳性血清和3份pedv阳性乳汁(经商品化试剂盒筛选)从1:100开始进行倍比稀释，采用本发明所建立的elisa方法进行检测，同时设阴性对照，评价该方法的敏感性。结果如表1，除3号乳汁样品外，其余样品当稀释度达到1:3200时，测得od450nm均大于0.43(临界值)，表明该方法具有较好的敏感性。
表1敏感性检测结果
特异性试验
用ps1-elisa方法分别对pedv、tgev、csfv、prrsv、prv、fmdv等病毒的阳性血清进行特异性检测，每份血清做3个重复，同时设立阴性对照和阴性血清，观察ps1-elisa的特异性。结果如表2，除pedv阳性血清对照外，其它血清检测结果均呈阴性，表明该方法具有较好的特异性。
表2特异性检测结果
重复性试验
取5份血清，用两批重组ps1蛋白包被酶联板各重复检测3次，应用spss统计学软件计算标准偏差及变异系数，对该elisa检测方法的重复性及稳定性进行统计分析。结果如表3所示，5份样品的od450变异系数(cv)均较小，平均值为4.92﹪(表3-5)，表明该方法具有较好的重复性。
表35份血清样品各用两批包被elisa板3次检测结果分析
疫苗免疫评价
采用本发明建立的elisa方法，对母猪免疫和未免疫t-p二联苗的两个猪群进行iga抗体检测。结果如表4所示，无论是母猪免疫猪群还是未免疫猪群，育肥猪和母猪的抗体阳性率总体上均比哺乳仔猪和保育猪高。另外，免疫猪群的血清抗体阳性率在不同年龄阶段均比未免疫猪群偏高，免疫猪群母猪乳汁中的iga抗体阳性率较未免疫猪群高。
表4免疫评价结果
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。