一种比率型荧光检测H2S的试剂及其合成方法和应用与流程

本发明涉及硫化氢检测技术，具体涉及一种比率型荧光检测h2s的试剂及其合成方法和应用。

背景技术：

硫化氢是一种无色有臭鸡蛋气味的气体，长久被认为是有毒的、对环境有害的。但近十几年来，大量的研究发现硫化氢在哺乳动物体内广泛存在，而且发挥着极其重要的生理作用。此外，研究表明硫化氢(h2s)是继一氧化氮(no)和一氧化碳(co)之后的第三种气体信号分子，具有多种生理功能。在植物体内，硫化氢发挥调节种子发芽，根系生长，叶子气孔打开与闭合，以及细胞渗透压，盐压等功能，在动物体内，硫化氢的作用包括调制血压，缓解缺血性再灌注损伤，发挥抗炎作用，调节细胞内氧化应激压力，降低代谢率等。硫化氢水平的改变与多种疾病相关，如唐氏综合征和阿尔茨海默氏病和心血管疾病等。硫化氢能够发挥降低血压，调节心率的作用。最新的研究发现，硫化氢具有降低癌症发病率的作用。到目前为止，已经有很多方法用来检测体内及体外硫化氢及硫氢根浓度，如：亚甲基蓝法、气相色谱及小分子荧光探针。其中，小分子荧光探针检测由于其具有高灵敏度、高选择性、非侵入性、操作简便及实时成像的特征，已被视为是最有前景的检测技术。

在本发明中，合成了7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(hs-1)，通过h2s反应前后荧光强度比值的变化，实现h2s的检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种比率型荧光检测h2s的试剂及其合成方法和应用。

本发明提供的一种比率型荧光检测h2s的试剂，是7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(hs-1)，英文名:7-(diethylamino)-2-oxo-2h-chromen-4-yl2-(pyridin-2-yldisulfanyl)benzoate，结构式为：

7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(hs-1)的合成方法，步骤为：

(1)在n2保护下，0℃时向丙二酸(1eq.)和苯酚(2eq.)的混合物中缓慢滴加过量的pocl3，混合物加热到115℃反应直到大量hcl气体被释放(大约1.5h)；上层清液被倾倒在水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，在旋转蒸发仪上旋干后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯；

(2)将化合物丙二酸二苯酯(1eq.)和间羟基-n,n-二乙基苯胺(1eq.)溶解在甲苯中，反应液回流7h；反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素；

(3)将二巯基吡啶(1eq.)溶于氯仿中，加入2-巯基水杨酸(1eq.)，滴加15mmol氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸；

(4)将化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(1eq.)，7-二乙胺基-4-羟基-香豆素(1eq.)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)(1eq.)，和4-二甲基氨基吡啶(dmap)(0.1eq.)，加入二氯甲烷中，室温搅拌12h；旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯。

一种比率型荧光检测h2s的方法，步骤为：

(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mm的hs-1的dmso溶液；

(2)、将2000μlph7.4的pbs缓冲溶液、5μlhs-1的dmso溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱；

(3)、将2000μlph7.4的pbs缓冲溶液、5μlhs-1的dmso溶液加到另外六个荧光比色皿中，分别再加入体积为0、40、80、120、160、200μl的h2s/hs^-溶液，在荧光分光光度仪上测定403/519对应的荧光强度比值r为0.27，1.00，2.54，4.31，5.71，6.64，以h2s浓度为横坐标，以荧光强度比r为纵坐标绘制图，得到h2s浓度的工作曲线；线性回归方程为：r＝0.036c-0.27，c的单位为μm；

(4)、将2000μlph7.4的pbs缓冲溶液和5μlhs-1的dmso溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取vμl待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入步骤(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品c待测样＝2000μl×c×10^-6/vμl,即可求得h2s的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、本发明的检测方法，对h2s显示了高的选择性；2、对h2s实现了比率型检测；3、可在纯水溶液中进行检测。

附图说明

图1实施例1制备的hs-1的核磁氢谱图

图2实施例1制备的hs-1的核磁碳谱图

图3实施例1制备的hs-1的质谱图

图4hs-1试剂与h2s作用的荧光发射图

图5hs-1试剂与各种分析物的荧光柱状图

图6用hs-1试剂测定h2s的工作曲线

图7用hs-1试剂测定样品的荧光发射图

具体实施方式

实施例17-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(hs-1)的合成及表征。

(1)在n2保护下，0℃时向丙二酸(11.0g，106mmol)和苯酚(19.95g，212mmol)的混合物中缓慢滴加pocl3(11.5ml，123mmol)，混合物加热到115℃反应直到大量hcl气体被释放(大约1.5h)。上层清液被倾倒在150ml水中，用乙酸乙酯萃取(3×100ml)，合并有机层，在旋转蒸发仪上旋发干后得棕色油状化合物丙二酸二苯酯(20.6g，产率98％)。

(2)将化合物1(12.8g，50mmol)和间羟基-n,n-二乙基苯胺(8.25g，50mmol)溶解在50ml甲苯中，反应液回流7h。反应完成后冷却至室温，有固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤，干燥，得黄色固体7-二乙胺基-4-羟基香豆素(8.7g，产率74％)。

(3)将二巯基吡啶(3.3g，15mmol)溶于80ml氯仿中，加入2-巯基水杨酸(2.31g，15mmol)，滴加15mmol氯化亚砜，搅拌1h，生成淡黄色固体，抽滤，干燥得到化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(5.5g，产率97％)。

(4)将化合物2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸(262mg，1mmol)，7-二乙胺基-4-羟基-香豆素(233mg，1mmol)，edc(192mg，1mmol)，和dmap(12.2mg，0.1mmol)，加入30ml二氯甲烷中，室温搅拌12h。旋转蒸发除去溶剂并将剩余物过硅胶柱，得到黄色固体7-(二乙基氨基)-2-氧代-2h-色烯-4-基2-(吡啶-2-基二硫烷基)苯甲酸酯(hs-1)(80mg，产率17％)。

产物hs-1表征结果见图1-3。

实施例2

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmhs-1的溶液；把2ml的pbs(ph7.4)溶液及5μlhs-1的dmso溶液加到荧光比色皿中，取h2s的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，加样的同时在荧光分光光度仪上检测，随着hs^-的加入，403nm的荧光强度逐渐增强，519nm的荧光逐渐减弱。荧光发射图见图4。

实施例3

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mm的hs-1溶液；在22个荧光比色皿中，各加入2ml的pbs(ph7.4)溶液和5μl的试剂的dmso溶液，再分别加入100μlh2s，以及100μl(2×10^-2m)的各种分析物：f^-,cl^-,br^-,i^-,cn^-,no3^-,no2^-so3^2-,scn^-,aco^-,co3^2-,so4^2-,clo2^-,clo3^-,clo4^-,hs^-,co3^2-,po4^3-,hco3^-cys,hcy和gsh在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的403/519相对荧光强度比值r的柱状图，(见图5)。h2s使得试剂的403/519荧光强度比值由0.27增加到8.54，其它的分析物基本没有引起试剂荧光强度比值的变化。

经实验证明，其它分析物不干扰体系对h2s的测定。

实施例4

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mm的hs-1溶液，用蒸馏水配制20mm的nahs溶液；把2mlpbs(ph7.4)溶液和5μl的试剂的dmso溶液加到荧光比色皿中，分别再加入体积为0、40、80、120、160、200μl的hs^-溶液，在荧光分光光度仪上测定403/519对应的荧光强度比值r为0.27，1.00，2.54，4.31，5.71，6.64，以h2s浓度为横坐标，以荧光强度比值r为纵坐标绘制图，得到h2s浓度的工作曲线(见图6)；线性回归方程为：r＝0.036c-0.27，c的单位为μm；

实施例5

配制ph＝7.4的pbs(10mm)缓冲溶液，配制20mm的nahs水溶液，并用dmso配制2mm的hs-1溶液；把2ml的pbs(ph7.4)溶液和5μl的hs-1的dmso溶液加到干净的荧光比色皿中，取nahs的溶液180μl，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定403/519的对应的荧光强度比值为6.16，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝178.611×10^-5mol/l，偏差为0.99％。见图7。