一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明涉及前列腺特异性抗原检测试剂和含有其的试剂盒。

背景技术：

前列腺癌(prostaticcancer,pca)是目前男性群体中多发的癌症，如果在早期就能够被及时诊断则可以有效地应对和治疗。前列腺特异性抗原(psa)自从几十年前被开发以来一直作为前列腺症临床诊断的主要蛋白类生物标志物。psa在血清中主要以游离psa和结合态psa存在，游离态称为fpsa，结合态称为(tpsa)psa，水平在4ngml^-1或者更低的情况下被认为是正常值，而超过4ngml^-1被认为是危险值。

传统的检测前列腺特异性抗原的方法有酶联免疫法(elisa)，放射性免疫测定(ria)，荧光法，化学发光法，电泳法，方法中多使用纳米金标记技术来获得放大信号，其操作复杂，且稳定性和重现性差。纳米材料在多次合成时很难保持结构和性能的一致，不利于检测结果的重现性。而基于各种dna工具酶的dna分子机器信号放大策略已经成为近几年来生物传感领域的研究热点。继聚合酶链式反应之后，恒温循环放大反应由于条件温和引起了研究者的注意。然而，虽然基于等温扩增技术的dna分子机器由于dna的优良可设计性和明显的放大作用被用于肿瘤疾病的检测，但是目前检测对象仅限于核酸类的肿瘤标志物或肿瘤细胞本身。核酸类肿瘤标志物基本上仅存在于肿瘤细胞内部，这就意味着在疾病检测过程中需要进行组织活检提取细胞等操作，检测过程对病人创伤比较大，不利于肿瘤疾病的早期、广泛筛查。而目前创伤比较小的血清类肿瘤标志物的检测由于检测方法的局限性，灵敏度远低于核酸类肿瘤标志物，无法满足血清中低丰度蛋白的灵敏检测。

中国专利申请cn10544356a公开了一种检测血清或精液中psa特异性抗原的新型前列腺特异性抗原检测试剂盒，其利用抗psa抗体-待测抗原-剪切酶修饰的抗psa第二抗体形成夹心结构，通过剪切酶引发dna分子机器循环放大信号，实现了高灵敏度定量检测psa特异性抗原。反应原理如图1所示，在上述检测试剂盒中，用于dna分子机器循环的反应物包括两条发卡dna链，其中一条含有茎环结构dna1，另一条为具有发夹结构的荧光探针dna2，此外还需要一条引物dna，聚合酶klenow和含有dntp的缓冲液。在反应循环中，第一个等温扩增循环在剪切酶，聚合酶作用下，dna1经剪切酶剪切后，dna片段被新生成的dna链取代，周而复始，释放出大量的dna片段。该dna片段与探针dna2的环区域互补可以打开它的发卡结构。然后，在短的引物dna链和聚合酶作用下，引物从探针dna2打开的颈的部位引发聚合反应。在此过程中引物在聚合酶作用下延伸，发生取代反应生出上述dna片段，发生了第二个等温扩增循环反应。反应一旦引发后，就会周而复始的发生聚合、剪切和取代反应，往复循环地产生大量的上述dna片段去打开更多的发卡探针dna2。在同一时间，由于探针dna2被上述dna片段打开，构象变化标记的荧光基团cy5和猝灭剂bhq分离，产生了一个明显的荧光信号，这样使信号放大有了明显的提高，实现了对待测样品中含有的psa抗原的检测。

在上述方法中，为了增强荧光检测信号，通过多重dna等温扩增循环反应实现，使用的反应体系复杂，成本高，不适于实际应用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种前列腺特异性抗原psa检测试剂。

本发明的另一个目的是提供检测前列腺特异性抗原的试剂盒。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测待测样本中前列腺特异性抗原的检测试剂，包括

固定于载体上的第一抗体，所述第一抗体为抗psa抗体；

磁性纳米微球，所述磁性纳米微球的表面修饰有第二抗体和剪切酶，所述第二抗体为抗游离psa抗体；以及

用于剪切酶与探针dna反应的dna反应液，所述dna反应液包括：

探针dna，所述探针dna为发卡结构，其dna链一端标记有荧光素，另一端标记有淬灭剂；和

反应缓冲液。

优选地，所述剪切酶为nb.btsi，所述探针dna具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。优选地将所述第一抗体包被于固相载体上，所述固相载体可以是微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒，更优选为微孔板。

上述检测试剂还可以包括标准品溶液，所述标准品为前列腺特异性抗原(psa)。

本发明主要的检测试剂为psa第一抗体、psa第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠、和剪切酶所作用的信号扩增反应液。

所述psa第一抗体、psa第二抗体可与抗原psa形成夹心物，而通过纳米磁珠和psa第二抗体偶联的剪切酶可用于引发荧光信号扩增反应。荧光信号扩增反应液含有茎环状发卡dna链，所述发卡dna链的链两端分别连有荧光素和淬灭剂。当发卡dna链被剪切酶切开后，淬灭剂与荧光素分离，释放荧光信号。

本发明的psa第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠上高密度地分布着剪切酶，这样使得低水平量的抗原psa可通过结合共标记纳米磁珠、剪切酶与荧光素/淬灭剂标记的发卡dna链反应级联放大信号。

本发明也提供含有上述检测试剂的试剂盒，所述试剂盒除含有上述检测试剂外，还可以包含通常检测所需要的洗涤液、样品稀释液，还可以包括试剂盒使用说明等资料。

更具体地，本发明的检测试剂盒包括，包被有psa第一抗体的微孔板、含有psa第二抗体和nb.btsi剪切酶共标记的纳米磁珠、含有荧光素/淬灭剂标记的发卡dna链的nebuffer缓冲液、psa标准品溶液，浓缩洗涤液，样品稀释液，试剂盒说明书。

有益效果：本发明创新性地设计了一种基于二抗和剪切酶修饰的磁性纳米球引发的dna分子机器循环放大的新型前列腺特异性抗原检测试剂盒，通过一抗/抗原/二抗的特异性夹心结构结合，使得磁性纳米球上的剪切梅引发了dna的不断剪切实现对信号的放大，进而实现对前列腺特异性抗原高灵敏和高特异检测。

本发明提供的前列腺特异性抗原psa检测试剂盒操作程序简单、灵敏度高、特异选择性好，适用于人体精液、血清中前列腺特异性抗原的快速、准确检测。

附图说明

图1:现有技术(cn10544356a)中检测psa的原理示意图；

图2:本发明荧光检测psa的原理示意图；

图3:荧光响应曲线；

图4:工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限制权利要求书范围。

本发明所用材料均为市售。

材料和设备：

前列腺特异性抗原(psa)(上海领潮生物有限公司)

抗-psa抗体(一抗，规格：l1c00401、批号:c130801)(上海领潮生物有限公司)

抗-游离psa抗体(二抗，规格:l1c00402，批号:c130601)(上海领潮生物有限公司)；

链霉亲和素修饰的磁性纳米材料(invitrogen)；

生物素-nhs、牛血清白蛋白(美国西格玛试剂公司)；

剪切酶nb.btsi、nebuffer缓冲液(纽英伦生物技术有限公司)；

荧光素/淬灭剂标记的发卡dna链(5’bhq-gcagtgagatttttttttttttttttttttttttctcactgc-3’fam，大连takara公司)；发卡dna链序列：seqidno.1：5’gcagtgagatttttttttttttttttttttttttctcactgc-3’；

碳酸钠、碳酸氢钠等基础药品(国药集团化学试剂有限公司)；

荧光分光光度计(f-4500型，日本,hitachi公司)。

设计思路：

如图2所示，首先含有前列腺特异性抗原第一抗体(ab1)的包被液，依次滴入96孔或48孔微孔板里，使酶标板底部修饰上一层ab1。通过抗体ab1、ab2与靶抗原antigen的夹心免疫反应将剪切酶nb.btsi修饰到微孔板的表面。然后，在微孔板中加入制备的反应缓冲液(发夹结构的荧光探针dna(在其末端修饰荧光基团fam和猝灭剂bhq)，)并在37℃条件下反应。此时，切酶nb.btsi剪切dna相应的位点，由于探针dna被切成两个片段导致荧光基团fam和猝灭剂bhq分离，产生了一个明显的荧光信号。因为一个磁珠上可以修饰大量的切酶，并且每个剪切酶能够切断大量的发夹结构的荧光探针dna，这样使信号放大有了明显的提高。没有靶抗原，剪切酶nb.btsi不能修饰到微孔板上，剪切反应就不会发生。

我们发现，靶抗原(psa)的量影响着荧光的最终信号，因为它反映剪切酶nb.btsi的量，剪切酶nb.btsi在实验中起着关键的作用。靶抗原的浓度的增加导致剪切酶nb.btsi的量的增加并产生一个明显的荧光增强信号。

借助elisa免疫吸附，以固定化psa第一抗体捕获样品psa，再以psa第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠相孵育，形成夹心结构(psa第一抗体/psa/psa第二抗体和剪切酶共标记的纳米磁珠)；而剪切酶又可切开荧光素/淬灭剂标记的发卡dna链，使得荧光素与淬灭剂分离，从而释放荧光信号，检测信号便可定量分析。

整体技术方案：

1、96孔或48孔微孔板的包被：制备含有前列腺特异性抗原第一抗体(anti-psa)的包被液，依次滴入96孔或48孔微孔板里，使酶标板底部修饰上一层anti-psa。然后用缓冲液洗涤微孔板，使用牛血清白蛋白封闭经洗涤的微孔板。

2、制备修饰有剪切酶和前列腺抗原第二抗体(anti-fpsa)的磁性纳米微球：首先将链霉亲和素标记的磁性纳米微球表面通过亲和素和生物素的亲和反应修饰上生物素-nhs，然后将第二抗体(anti-fpsa)和剪切酶nb.btsi按照一定的比例修饰到磁性纳米材料表面，最后通过磁性分离除去溶液中没有结合到磁性纳米材料表面的多余第二抗体(anti-fpsa)和剪切酶nb.btsi，从而制备成了修饰有anti-fpsa和剪切酶的磁性纳米微球。

3、前列腺特异性抗原的检测：把含有前列腺特异性抗原的待测液加入到微孔板的孔里，使固定于板上的前列腺抗原的第一抗体与待测抗原特异性结合；加入制备好的修饰有anti-fpsa和剪切酶nb.btsi的磁性纳米微球，构成抗体/抗原/抗体的夹心结构。加入剪切酶所作用的反应液(发卡探针dna溶液)，即含有1条标记荧光素和猝灭剂的发卡探针dna链的nebuffer缓冲液，引发dna分子机器，切断发卡dna，使修饰其两端的荧光素和猝灭剂互相远离，呈现荧光信号。

4、荧光强度测试：通过实验选择系列标准品浓度为0，0.2，0.8，1.6，3.2，8.6，11.0，20ngml^-1。

5、配制试剂盒其他组分：20倍浓缩洗涤液(含有0.05％吐温-20的0.02m磷酸盐缓冲液，ph＝7.4)、样品稀释液(灭活的小牛血清)、剪切酶所作用的反应液为发卡探针dna链的nebuffer缓冲液。

6、鉴定该方法制成试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性合格。

7、根据试剂盒的需要量将这些组分分装在小瓶中，组装为成品。

实施例1【检测试剂盒的配置与检测调试】

1.1试剂配置

psa第一抗体、20倍浓缩洗涤液(含有0.05％吐温-20的0.02m磷酸盐缓冲液，ph＝7.4)、样品稀释液(灭活的小牛血清)、含有荧光素/淬灭剂标记的发卡dna链的nebuffer缓冲液。

1.2检测调试操作步骤

配制psa系列标准品，其浓度为0、0.2、0.8、1.6、3.2、8.6、11.0、20ngml^-1。

(1)微孔板的包被：用包被缓冲液(50mm碳酸钠、50mm碳酸氢钠、ph＝9.6)溶解psa第一抗体，使psa第一抗体浓度为10μg/ml，以100μl/孔加入到微孔板中，4℃放置过夜。第二天弃去包被液后，用蒸馏水洗涤3次，每孔加入150μl1％牛血清白蛋白，37℃封闭1h。

(2)制备修饰有前列腺抗原第二抗体和剪切酶的磁性微球：取200μl链霉亲和素修饰的磁珠，洗涤后加入100μl0.5μg/mlpsa第二抗体和100μl剪切酶nb.btsi(1u/μl)反应90min，洗涤后备用。

(3)每孔加入100μl待测抗原溶液反应90min，洗涤后加入100μl修饰有psa第二抗体和剪切酶共标记的磁性微球反应90min，洗涤后加入浓度为含有10^-6m的发卡dna的nebuffer缓冲液，于微孔板中反应90min。

(4)荧光测试：上述反应完后，将反应液放入荧光分光光度计中进行荧光测试。

以psa标准品溶液鉴定，该试剂盒的准确度、灵敏度、精密度和稳定性均合格。

如图3所示，随着psa浓度的升高，荧光信号强度增加。将每条曲线在518nm处的峰值荧光对浓度的对数值作图，工作曲线见图4所示。当psa浓度在0.2ngml^-1到100ngml^-1的范围内，荧光响应与其呈线性关系，回归方程为i(a.u.)＝67.63+148.9logc(psa,ngml^-1)，该试剂盒对列腺抗原(psa)的检测限为0.2ngml^-1。

根据试剂盒的需要量将这些组分分装在小瓶中，组装为成品试剂盒。

实施例2【检测试剂盒的使用方法】

1、自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡20分钟，取一瓶浓缩洗液，加蒸馏水(1ml+19ml)备用。

2、将微孔板从密封袋中取出，将洗涤液注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液，重复洗板，最后在干净的吸水纸上拍干。

3、设系列标准品浓度各2孔，每个样品孔2孔，取标准品或样品溶液各50μl置于对应板孔中，微量振荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板，然后置反应板37℃温育30分钟。

4、小心甩去反应液，然后洗涤五次同步骤2。

5、取psa第二抗体和剪切酶共标记的磁珠溶液100μl置于对应板孔中，微量振荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板，然后置反应板37℃温育30分钟。

6、小心甩去反应液，然后洗涤五次同步骤2。

7、于对应板孔中加入剪切酶所作用的信号扩增反应液(发卡dna链的nebuffer溶液)200μl，微量振荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板，然后置反应板37℃温育60分钟后对溶液荧光强度进行测量。

8、用对数坐标以荧光强度值对psa浓度对数作图，通过标准曲线对样品血清中psa实现定量分析。

与cn105044356a的技术方案(方案1)相比，两个方案的灵敏度和检测限相似(方案1为：0.5ngml-1，本发明(方案2)为：0.2ngml-1)，方案1主要是通过剪切酶、两条发卡dna链、一条引物链、聚合酶klenow、dntp的nebuffer缓冲液所形成的dna多重等温循环放大策略来增强荧光信号，反应体系复杂，试剂成本高；而方案2是通过在磁珠表面增加剪切酶的量来增加剪切酶切断大量发夹结构的荧光探针dna，从而增加荧光信号。反应体系简单，试剂成本大大降低。

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<120>一种前列腺特异性抗原检测试剂与试剂盒

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