诊断神经变性疾病的方法与流程

本申请是申请号为201180047665.2，申请日为2011年8月10日，发明名称为“诊断神经变性疾病的方法”的中国专利申请的分案申请。

本发明涉及诊断神经变性疾病、特别是阿尔茨海默病的方法。

背景技术：

神经变性疾病的诊断并不容易。因此，对于阿尔茨海默病，根据常规"nincds-adrda"标准(mckhannetal.,(1984)neurology34:939-944)，在患者尸体解剖和脑神经病理检查表明一方面存在老年斑，另一方面存在神经原纤维变性后，区分可能的阿尔茨海默病、很可能的阿尔茨海默病以及明确的阿尔茨海默病，同时仅在验尸后可能建立明确的阿尔茨海默病的诊断。

可能的或很可能的阿尔茨海默病的诊断，实质上基于临床标准和神经心理学测验，所述测验首先旨在确立个体是否表现出痴呆综合征，这通常根据dsmiv标准(diagnosticandstatisticalmanualformentaldisorders,4thedition,americanpsychiatricassociation,1994)来进行，接着确定痴呆的病因。痴呆的标准基本上包括记忆障碍和对社会-职业活动具有影响并且与以前的功能相比导致衰退的其他认知功能障碍。通过监测患者的进展，加强诊断，这使得指明痴呆的原因成为可能，特别是，通过排除认知衰退的其他原因。在这方面，通过评估局部海马萎缩，并通过排除认知障碍的其他原因，如中风的副作用，脑成像是诊断的重要要素，然而，海马萎缩可以存在于侵袭老年人的其他疾病中。

然而，通常认为，仅约85％的很可能的阿尔茨海默病病例在死后得到证实。15％的假阳性通常起因于其他神经变性疾病，如额颞痴呆，包括特别是具有路易体的痴呆(delacourte(1998)annalesdebiologieclinque56:133-142)。因此，目前的诊断阿尔茨海默病的方法缺少特异性。另外，看起来，在出现第一认知障碍所限定的疾病引发与可以引起可能的或和很可能的阿尔茨海默病诊断的建立的痴呆首发症状之间，存在超过10年的时间段(amievaetal.(2008)ann.neurol.64:479-480)。因此阿尔茨海默病的诊断一般是晚期建立的，然而该疾病完全处于晚期。然而，为了有效，目前为阿尔茨海默病所设想的治疗需要从病理过程开始时即进行，例如当待治疗的个体仍然表现出轻度认知障碍(mci)时，这意味着要能早期诊断所述疾病。

实际上，可以进行辅助检查，如分析患者脑脊液中的生化标志物，以便改善阿尔茨海默病的诊断。因此，已经特别证明，测定脑脊液中β-淀粉样蛋白1-42肽(aβ42)的水平和tau(tubulinassociatedunit，微管蛋白相关单元)肽的总水平，即磷酸化形式和非磷酸化形式，使得诊断阿尔茨海默病成为可能，且灵敏度为92％，特异性为89％(sunderlandetal.(2003)jama289:2094-2103)。此后，除了aβ42和总tau(t-tau)外，增加了第三个标志物，即磷酸化的tau(ptau)，特别是在苏氨酸181(ptau181)上磷酸化。此外，已可表明，这三种标志物的组合可能检测患有mci的个体的初期阿尔茨海默病，其灵敏度为83％，且特异性为72％(mattesonetal.(2009)jama302:385-393)。

然而，在目前，这些检测并不能以常规方式进行，部分原因是，它们在诊断阿尔茨海默病的可靠性和阿尔茨海默病早期诊断方面实现的增益，通常不足以证明求助于所述检测是正当的。

双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其主要靶标是真核翻译起始因子2α(eif2α)。通过446位的苏氨酸和/或451位的苏氨酸的磷酸化，pkr以激活的形式存在。已经可证明，特别是在患有阿尔茨海默病、亨廷顿病以及克雅氏病患者的脑中以及在患有阿尔茨海默病患者的血液淋巴细胞中高水平的激活的pkr(对于综述，参见hugonetal.(2009)expertrev.neurother.9:1455-1457)。

技术实现要素：

本发明由本发明人的证明而来，即测定个体脑脊液中pkr的水平，特别是磷酸化的激活形式的pkr的水平，具有选择性且特异性诊断这些个体的阿尔茨海默病的用途，包括在所述疾病的初期或早期阶段，任选地无症状阶段。

因此，本发明涉及特别是体外诊断个体的神经变性疾病的方法，其中：

-测定来自所述个体的生物样品中特别是脑脊液样品中双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)的水平，

-由此推断所述个体是否患有神经变性疾病。

本发明还涉及特别是体外诊断个体的神经变性疾病的方法，其中：

-测定来自所述个体的生物样品中、特别是脑脊液样品中激活的pkr的水平与总pkr水平的比，

-由此推断所述个体是否患有神经变性疾病。

本发明还涉及特别是体外诊断未表现出痴呆症状的个体的神经变性疾病的方法，其中：

-测定来自所述个体的生物样品中、特别是脑脊液样品中双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)的水平，

-由此推断所述个体是否患有神经变性疾病。

本发明还涉及用于测定未表现出神经变性疾病症状的个体会患有神经变性疾病的风险的方法，特别是体外方法，其中：

-测定来自所述个体的生物样品中、特别是脑脊液样品中双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)的水平，

-由此推断所述个体是否处于发展神经变性疾病的风险中。

如本文所意图的，措辞"神经变性疾病"表示变性疾病，即影响神经系统、特别是脑的渐进性退化疾病。

优选，本发明的神经变性疾病是痴呆。痴呆是本领域技术人员熟知的；通常认为痴呆的特征是个体的智力功能渐进性恶化，因此危害其适应环境的能力，特别是在面对新形势时，这导致其丧失自主性。优选，根据本发明，痴呆的症状特别是美国精神病学会(americanpsychiatricassociation,dsmiv)有关阿尔茨海默病型痴呆的手册:diagnosticandstatisticalmanualformentaldisorders,4thedition(1994)所限定的那些症状，即：

a.发展出同时通过以下表现其自身的多种认知缺陷：

(1)记忆障碍(获悉新信息和记住以前所获悉的信息的能力降低)；

(2)一种(或多种)下述认知障碍：

(a)失语症(语言障碍)，

(b)失用症(尽管运动机能完整，但是进行运动活动的能力降低)，

(c)失认症(尽管感觉功能完整，但是不能识别或确定物体)，

(d)执行功能(即规划、组织、顺序分解、抽象思考)障碍。

b.标准a1和a2的认知缺陷各自引起明显的社会或职业功能障碍，并且与以前的功能水平相比，表现出明显下降。

c.发展的特征是渐进性引发和持续认知下降。

d.标准a1和a2的认知缺陷不是由于任一下述所致：

(1)引起渐进性认知和记忆缺陷的其他神经系统疾病(例如，脑血管疾病、帕金森病、亨廷顿病、硬脑膜下血肿、正常压力脑积水、脑瘤)；

(2)已知引起痴呆的系统病(例如，甲状腺功能减退、维生素b12或叶酸缺乏症、烟碱酸缺乏症、高钙血症、神经梅毒、hiv感染)；

(3)物质诱导的疾病。

e.仅在精神错乱期间发生所述缺陷。

f.所述问题不能更好地理解为由另一axisi病症(在dsmiv的涵义内，即需要及时关注)(例如，重度抑郁症或精神分裂症)所引起的。

优选地，本发明的神经变性疾病选自阿尔茨海默病、亨廷顿病、克雅氏病以及帕金森病。

特别优选的是，本发明的神经变性疾病是阿尔茨海默病。

本发明的个体优选是人类。本发明的个体可以表现出一种或多种痴呆症状或可以患有痴呆。

本发明的个体还可能未患有痴呆或未表现出痴呆症状。当未表现出痴呆时，本发明的个体可能患有认知障碍，特别是轻度认知障碍(mci)，这是本领域技术人员熟知的，特别是如petersenetal.,(1999)arch.neurol.56:303-308所限定。在主诉涉及客观上明显的记忆功能缺陷与缺乏日常生活活动的全面认知和智力功能和完整性的情况下，个体通常被解释为患有mici。优选，根据本发明，患有mci的个体具有简明精神状态检查量表(minimentalstateexamination,mmse)检测、特别是两愿版本的groupederéflexionsurlesevaulationscognitives(greco)[认知评估研究组]评分，作为其年龄与其社会文化水平的函数，所述评分高于对应于第5个百分点的评分。此外，本发明的个体可能还未表现出任何认知障碍。

当本发明的个体未患有痴呆、特别是未患有阿尔茨海默病时，或未表现出痴呆、特别是阿尔茨海默病的任何症状时，特别是，具体而言，当所述个体患有mci，本发明的方法使得特别是在初期或早期、甚至无症状阶段确定所述个体是否患有痴呆、特别是阿尔茨海默病成为可能，或使得确定所述个体是否处于发展痴呆、特别是阿尔茨海默病风险成为可能。

同样优选，来自所述个体的脑脊液样品中神经变性疾病的至少以一种生物标志物的水平是正常的。如本文所意图的，当神经变性疾病的生物标志物的水平小于本领域技术人员普遍接受的用于将个体诊断为患有与所述标志物相关的神经变性疾病的阈值时，则认为所述神经变性疾病的生物标志物的水平是正常的。神经变性疾病、特别是阿尔茨海默病的许多生物标志物是本领域技术人员已知的。优选，根据本发明，神经变性疾病的生物标志物是阿尔茨海默病的生物标志物，特别是选自标志物β-淀粉样蛋白(aβ)特别是β-淀粉样蛋白1-42(aβ42)、总tau(t-tau)，以及磷酸化的tau(ptau)、特别是在苏氨酸181上磷酸化的tau(ptau181)。这些标志物和用于测量其在脑脊液样品中水平的方法，是本领域技术人员熟知的，并特别限定于sunderlandetal.(2003)jama289:2094-2103,blennowetal.(2006)lancet368:387-403和mattsonetal.(2009)jama302:385-393中。

双链rna依赖性蛋白激酶(pkr)也称为e2ak2，其是本领域技术人员熟知的，并且特别是限定于hugonetal.(2009)expertrev.neurother.9:1455-1457或由uniprotkb数据库的登录号p19525限定。如本文所意图的，措辞"双链rna依赖性蛋白激酶"或"pkr"与非磷酸化的pkr无差别地指在446位的苏氨酸(ppkr446)和/或451位的苏氨酸(ppkr451)磷酸化的pkr(ppkr)，或指所有这些pkr形式。本发明生物样品中磷酸化和非磷酸化形式的pkr的全体也称为总pkr。

因此，在本发明的诊断或风险确定方法的一个优选实施方式中，基于样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平，基于样品中总pkr的水平，或基于样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平与所述样品中总pkr水平的比，推断个体患有神经变性疾病、特别是阿尔茨海默病。在本发明的诊断或风险确定的方法另一优选实施方式中，基于以下的比较，推断所述个体患有神经变性疾病、特别是阿尔茨海默病：

-样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平，样品中总pkr的水平，或样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平与所述样品中总pkr的比，与

-至少一个预定的值，特别是当样品中磷酸化的、特别是ppkr446的水平，样品中总pkr的水平，或样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平与所述样品中总pkr的水平的比，大于所述预定值时。

本领域技术人员能够容易地测定本发明的预定值。特别是，其可以是本发明pkr的平均水平，或来自未患有认知障碍的对照个体的csf样品中多个大于1的这种平均水平。其也可以是从接受操作特征(receivingoperatingcharacteristics,roc)曲线所获得的阈值，如下述实施例所述，通过固定具体选择性和特异性值，特别是用于最大化选择性和特异性的总和，针对总pkr、磷酸化的pkr特别是ppkr446，或样品中磷酸化的pkr特别是ppkr446的水平与样品中总pkr的水平的比建立所述曲线。因此，作为实例，根据本发明，当样品中磷酸化的pkr、特别是ppkr446的水平与所述样品中总pkr的水平的比大于0.76或0.77时，个体被诊断为患有阿尔茨海默病。

而且，在另一具体实施方式中，本发明的诊断或风险确定方法还包括测定神经变性疾病特别是阿尔茨海默病的如上文所限定的至少一种其他生物标志物的水平。

本发明的生物样品优选是流体生物样品、更优选脑脊液(csf)的流体生物样品。本领域技术人员完全了解如何从个体获得csf，例如通过腰椎穿刺。

优选地，在本发明的方法中，本发明的生物样品中本发明的pkr水平，借助免疫学方法测定，即利用下述的方法：特异性抗pkr即基本上不结合生物样品、特别是csf样品的任何其他组分的抗体、特别是单克隆抗体、包含抗体的特异性结合抗原的一部分的抗体片段或其他适体。正如对本领域技术人员显然的是，用于测量总pkr水平的抗体针对未被磷酸化修饰的pkr的一部分；相反，用于测量ppkr446或ppkr451水平的抗体结合pkr的磷酸化的一部分(并且不结合未磷酸化的同一部分)。这类抗pkr抗体是本领域技术人员熟知的。根据本发明，免疫学方法是本领域技术人员熟知的，并且特别涵盖蛋白质印迹或elisa技术。

借助下文的附图和实施例，会以非限制性方式进一步说明本发明。

附图说明

图1、2和3

图1-3以箱形图表示，与未患有认知障碍的对照个体的csf中所测量的(对照)相比，在患有阿尔茨海默病(ad)的患者的csf中测量的总pkr(pkr)的水平(任意单位)(图1)、ppkr446(ppkr)的水平(任意单位)(图2)以及ppkr446/总pkr比乘以100(ppkr/pkr)(图3)。

图4、5和6

图4-6表示roc曲线，其给出了基于总pkr水平(图4)、ppkr446水平(图5)以及ppkr446/总pkr比(图6)进行阿尔茨海默病诊断的灵敏度(y轴)和1-特异性(y轴)。

图7

图7表示csf中ppkr446/总pkr比乘以100(ppkr/pkr，y轴，任意单位)与ptau181水平(ptau,x-轴,pg/ml)之间的关系以及相应的线性相关线。

图8

图8表示下述的csf中ppkr446的水平与总pkr水平的比(y-轴，任意单位)：患有阿尔茨海默病(ad)、特别是具有正常(ad-pln)或中间(ad-pli)水平的aβ42、t-tau以及ptau181标志物的患者；未患有认知障碍的对照个体(hc)；患有非阿尔茨海默病相关认知障碍的对照(cc)；患有酒精性痴呆的个体(oh)；以及患有轻度认知障碍(mci)的个体。

图9、10、11

图9-11分别表示在实施例3中所测量的对照个体(nc)、患有遗忘型轻度认知障碍(mci)的个体和患有阿尔茨海默病的个体的scf中总pkr和ppkr446水平(光密度单位)以及ppkr446/总pkr比(无单位)。实心水平条表示平均值，而虚线水平条表示阈值。

具体实施方式

实施例

实施例1

1.患者和方法

患者

本研究包括46名诊断为患有阿尔茨海默病(ad)的患者和39名未患有阿尔茨海默病的对照个体。基于nincds-adrda标准收入ad患者。所有的患者均来自lariboisière医院的centremémoire[记忆中心](法国巴黎)。没有对照个体表现出任何认知障碍且满足阿尔茨海默病标准。在常规诊断程序下，联合神经学检查、常规血液试验、神经心理学测验以及脑mri成像，在腰椎穿刺后，收集脑脊液(csf)样品。研究获得了巴黎nordbichat医院伦理委员会(parisnordbichathospital)的许可。

利用蛋白质印迹分析csf：测定总pkr和在苏氨酸446上磷酸化的pkr(ppkr446)的水平

用柱(proteoextract^tm,)预处理csf样品，以便除去白蛋白和igg，随后根据蛋白质印迹的标准技术制备。利用microbcaproteinassay试剂盒(thermoscientific)，根据制造商的说明书，测定蛋白浓度。在nupagebistris4-12％聚丙烯酰胺凝胶(invitrogen)上分离csf样品，并随后电转移到硝酸纤维素膜(gehealthcare)上。将膜与分别识别特别是在磷酸化的苏氨酸446处的ppkr446和所有pkr蛋白的兔一抗(santacruz)一起孵育、在5％乳的pbs溶液中封闭，并随后在存在稀释至1/5000的、偶联于抗兔抗体(rocklandimmunochemicalinc.)的irdye^tm800荧光团的情况下孵育。借助odyssey成像系统(li-corbiosciences)显示结合的蛋白，随后通过密度测定法利用multigauge软件(fuji)定量。测定每一患者和每一对照个体的ppkr446/总pkr比。相对于内部对照(患有阿尔茨海默病的人脑)，调整所有结果。借助版本5的prism软件(graphpad)进行定量结果的统计分析。

通过elisa分析csf：β-淀粉样蛋白1-42(aβ42)、总tau(t-tau)、在苏氨酸181磷酸化的tau(ptau181)

根据制造商的推荐，利用elisa(innotesttestsabeta,innoteststau,innotestsp181tau,innogenetics,ghent,belgium)测定与用于测定总pkr和ppkr446水平相同的csf样品的aβ42、t-tau和ptau181水平。

统计分析

用描述统计学描述患者和对照的特征。利用斯氏t检验比较所述组的连续测量结果，并利用chi²检验比较比例。用箱形图图表方法表示两个组(患者和对照)的总pkr和ppkr446水平分布和ppkr446水平与总pkr水平的比(ppkr446/总pkr)。用roc(接受操作特征)曲线分析测定所测量的csf标志物水平的最佳截止值，并计算曲线下面积(auc)。最佳截止值定义为给出灵敏度和特异性的最高总和。还测定一方面pkr与ppkr446之间和另一方面aβ42、t-tau以及ptau之间的斯皮尔曼相关系数。

2.结果

下文的表1给出了所研究个体的特征：

表1:本研究中个体的特征

除了女性数量，所示的值表示个体的平均值，标准偏差显示于括号内。mmse：简易精神状态检查表表认知检测的评分。

表中的数据表明，与对照个体相比，pkr和激活的pkr(ppkr446)浓度平均值，和ppkr446/pkr浓度比的平均值，在患有阿尔茨海默病的患者的csf中明显更高。

总得来说，图1,2和3给出的箱形图表证实了这些观察的数据。特别是，所获得的对照个体的ppkr446浓度和ppkr446/总pkr比的数值组，明显低于患有阿尔茨海默病的患者的值。

此外，建立总pkr、ppkr446和ppkr446/总pkr比的roc曲线。下表2给出了由这些曲线获得的灵敏度和特异性数据。

表2：roc曲线的曲线下面积(auc)

利用总pkr、特别是激活的pkr(ppkr446)的水平和ppkr446/总pkr比，使得检测患有阿尔茨海默病的患者成为可能。特别是，观察到与诊断标志物aβ42、t-tau和ptau181所提供的检测相比，测定激活的pkr(ppkr446)水平和ppkr446/总pkr比能更灵敏地检测阿尔茨海默病。

一方面aβ42、t-tau和ptau181标志物之间以及另一方面总pkr、ppkr446和ppkr446/总pkr标志物之间的斯皮尔曼相关系数，在下文的表3和图7中给出。

表3：斯皮尔曼相关系数

一方面aβ42、t-tau和ptau181标志物之间以及另一方面总pkr、ppkr446和ppkr446/pkr标志物之间的斯皮尔曼相关系数是相对低的。因此，这两组标志物看起来彼此相对独立，这使人想到，将本发明的标志物与aβ42、t-tau和ptau181组合可改善后者的诊断效率。

实施例2

采用实施例1的方法，本发明人还将实施例1所示的所选患有阿尔茨海默病(ad)患者csf中ppkr446水平与总pkr水平的比，与未患有认知障碍的对照个体(hc)的、患有非阿尔茨海默病相关认知障碍(例如继抑郁或继另一精神病症、继额颞痴呆、继血管性痴呆或继路易体疾病之后的认知障碍)的对照(cc)的、患有酒精性痴呆的个体(oh)的以及患有轻度认知障碍(mci)的个体的csf中所测量的相同比进行了比较(图8)。

观察到，在患有阿尔茨海默病的患者的csf中，ppkr446/总pkr比值的平均值高于未患有认知障碍的对照个体的csf中的平均值(如在实施例1中所观察到的)，并且也高于患有酒精性痴呆的个体的csf中的平均值，而且患有酒精性痴呆的个体的平均值与未患有认知障碍的对照的平均值相似。在目前情况下，这表明，ppkr446/总pkr比值升高是阿尔茨海默病特异性的，并且很可能且更通常对神经变性痴呆是特异性的。

还观察到，患有轻度认知障碍(mci)个体的csf的ppkr446/总pkr比平均值与患有阿尔茨海默病的患者以及与未患有认知障碍的对照个体的平均值相比介于中间。在患有mci的个体转化成患有阿尔茨海默病的年转化率为约15％的情况下，其中有一些所述个体随后并未发展出阿尔茨海默病，很可能是，患有mci的个体中ppkr446/总pkr比的升高，表示存在初期或早期阶段的阿尔茨海默病(即在出现痴呆症状之前)，或其表示个体处于在短期内发展阿尔茨海默病风险中。此外，患有非阿尔茨海默病相关认知障碍的对照个体的csf中ppkr446/总pkr比与未患有认知障碍的对中的比相似，这表明，患有mci个体中ppkr446/总pkr比升高是阿尔茨海默病特异性的，且很可能更通常是神经变性病症特异性的。

最后观察到，尽管有一些患有阿尔茨海默病的患者在csf中表现出是正常的(ad-pln)或中间的，即介于正常限度和病理限度(ad-pli)之间的aβ42、t-tau以及ptau181标志物水平，但是，ppkr446/总pkr比的值升高，这表明，这种比可以用来鉴定患有阿尔茨海默病，但不能利用常规标志物鉴定的患者。

实施例3

进行与实施例1的研究互补的临床研究。

1.患者与方法

患者

本研究在一年中包括访问lariboisière医院(法国巴黎)的centremémoire[记忆中心]进行脑脊液(csf)分析以便研究认知障碍的119名连续个体。由于数量低，将患有额颞痴呆或路易体疾病的5名个体排除出本研究，并且将曾中风、具有大于4的hachinksi缺血性量表平分或患有心血管疾病伴随脑mri中可见的后果(多重大血管梗死、关键位置的单个梗死、多个基底神经节、白质缺口、广泛的脑室周围白质损伤)的6名个体排除出本研究。在诊断之前，对所有个体进行标准临床检查，包括病史和体格检查与神经学检查。对所有个体进行实验室检测，包括测量血清钴胺素和叶酸水平、化学测试(chemistrypanel)、甲状腺功能检测、梅毒血清学，测量反应蛋白c水平、完整的血液检查以及脑mri。由专门研究认知障碍的神经病学家和神经心理学家的多学科小组建立诊断。根据nincds-adrda标准(mckhannetal.(1984)neurology34:939-44)建立阿尔茨海默病的诊断，并且患有遗忘型轻度认知障碍(mci)的个体满足了一般标准(petersenetal.(2001)arch.neurol58:1985-92)。本研究获得了巴黎大学医院中心伦理委员会(ceerbchubichat,paris,france)的许可。所有个体和护工都出具了有关csf分析的书面知情同意书。

csf相关程序

临床诊断后1个月内，在未进食的一段时间后，对个体进行腰椎穿刺。将csf连接于12ml聚丙烯管中。在2个小时内，于4℃下、以1800g将csf样品离心10min(分钟)。小量csf用于常规分析，包括总细胞计数、细菌学检测以及总葡萄糖和蛋白水平。在等待分析的同时，将csf分装到500μl聚丙烯管中，并储存于-80℃。利用innotestelisa夹心检测，根据制造商的说明书(innogenetics,ghent,belgium)，测量csf中aβ42、t-tau和ptau181的水平。根据lariboisière医院centremémoire[记忆中心]所用的截止阈值(aβ42<500pg/ml；t-tau>302pg/ml；ptau181>65pg/ml)，将生物标志物阳性标准定义为aβ42、t-tau和ptau181水平异常的函数。在单个实验室中进行这组生物学分析。参与csf分析的生物学家团队未接到临床诊断的通知。csf分析的质量获得欧洲联盟(europeanconsortium)(qualitycontrolprogramforcsfbiomarkersofthealzheimer'sassociation，阿尔茨海默病协会csf生物标志物质量控制方案)的证实。

测定csf中pkr和ppkr446的水平

根据制造商的说明书，在柱(proteoextract^tm,darmstadt,germany)上预处理csf样品，以便除去白蛋白和igg。简而言之，将800μl平衡缓冲液添加于柱中，从而使其再水化。随后将300μl每一csf样品置于各个一次性柱上，并通过重力洗脱。在借助制造商所提供的特定结合缓冲液洗涤2次而洗脱柱后，获得过滤的样品。将已经除去igg和白蛋白的样品制成等分试样，并储存于-20℃。借助免疫标记分析、利用抗人血清白蛋白的抗体(santacruz,danvers,ma,unitedstates)，评估过滤步骤的效率。利用microbcaproteinassay试剂盒(thermoscientific,cergy-pontoise,france)，根据制造商的说明书，测定蛋白浓度。

在nupagebistris4-12％聚丙烯酰胺凝胶(invitrogen)上分离csf蛋白样品，随后以400ma/凝胶，在25mmtris(ph8.3)、200mm甘氨酸和20％乙醇中，将其电转移到硝酸纤维素膜(gehealthcare,chalfontst.giles,unitedkingdom)上。转移后，在5％(重量/体积)乳的tbs溶液中封闭硝酸纤维素膜,并随后与一抗一起孵育。

使用下述一抗。兔抗pkr446抗体(santacruz)、兔抗pkr抗体(cellsignaling,beverly,ma,unitedstates)、小鼠抗血清白蛋白抗体(santacruz)。使用缀合于irdye^tm700dx荧光团的抗小鼠igg和缀合于irdye^tm荧光团的抗兔igg(rocklandimmunochemicalinc.,gilbertsville,pa,unitedstates)作为二抗。利用odyssey成像系统(li-corbiosciences,lincoln,ne,unitedstates)显示结合的蛋白，随后通过密度测定法利用multigauge软件(fujifilm,tokyo,japan)进行定量。测量结果以光密度单位(odu)表示。

为了评估总pkr和ppkr446水平测量的可靠性，本发明人对25个随机选择的个体的csf进行了复测研究(test-reteststudy)，并计算总pkr和ppkr446水平的两次连续测量之间的同类相关系数。

统计分析

根据其临床诊断(神经病学对照或对照(nc)、轻度认知障碍(mci)和阿尔茨海默病(ad))，提出所述个体的特征，并利用类别变量的χ²检验和连续变量的方差分析在三组间进行比较。用roc(接受操作特征)曲线分析测定总pkr、ppkr446和ppkr446/总pkr比区分nc与ad个体的识别能力。通过最大化尤登指数(灵敏度+特异性-100)，确定最佳截止阈值。利用皮尔逊相关系数，评估各种生物标志物之间的相关性。所有p值都是两面的，并且小于或等于0.05的p值被视为是统计上显著的。利用版本9.2的sas软件(sasinstitute,cary,northcarolina,unitesstates)和版本10.0的stata软件(statacorplp,collegestation,texas,unitedstates)进行统计分析。

2.结果

在所包括的108名个体中，由于与csf分析相关的技术原因(8个是由于csf的量不足，9个因为csf中蛋白的浓度太低)，排除了6例ad、10名对照(nc)以及1例mci。这些个体在年龄和性别比方面与所包括的个体并无不同。因此，本研究最后包括了总计91名个体(ad,n＝45；遗忘型mci,n＝11；nc,n＝35)。因其认知主诉(重度焦虑-抑郁病症14、中风并发症5、酒精性痴呆4、睡眠呼吸暂停综合征2、肖格伦综合征2、肉状瘤病1、多发性硬化2、肌萎缩性脊髓侧索硬化1、莱姆病1、正常压力脑积水1、癫痫1、周围神经病1)，而将nc个体定向至lariboisière医院的centremémoire[记忆中心]。

下文表4给出了ad、mci和nc的临床特征。

表4：本研究个体的特征

除了女性的数量之外，所示的值表示个体的平均值，标准偏差显示于括号内；mmse：简易精神状态检查表认知检测的评分；#光密度单位

与ad个体相比，nc个体的平均年龄稍小。与nc个体相比，ad和mci个体的csf生物标志物aβ42、t-tau以及ptau181明显不同。对于3组个体，测定相同的csf样品的总pkr和ppkr446水平和ppkr446/总pkr比。总pkr的水平，特别是pkr446的水平，在ad患者中升高。

特别是，观察到在总pkr和ppkr446水平以及ppkr446/总pkr比方面，三组存在统计上显著的差异。例如，在nc个体中ppkr的平均值是29.0+/-13.9，在mci个体中是85.0+/-40.4，以及在ad个体中是92.3+/-38.0(odu)。这在呈现了个体的结果和下文测定的阈值的图9-11中也可以看出来。

对于区分ad和nc个体，下表5给出了所建立的总pkr水平、ppkr446水平以及ppkr446/总pkr比的roc曲线的结果。

表5:roc曲线的曲线下面积(auc)

se：标准误差

对于ppkr446而言，曲线下面积(auc)是0.98，且对于ppkr446/总pkr而言，曲线下面积为0.95。因此，ppkr446的51.8odu的阈值，使得区分ad个体与nc个体成为可能，灵敏度为91.1％，特异性为94.3％。这些值与相同的csf样品中所测定的aβ42、t-tau和ptau181的值在相同的数量级。注意，不管所考虑的标志物如何，包括常规csf标志物aβ42、t-tau以及ptau181在内，与ppkr446相关的auc值是最好的。

对25个csf样品(10nc、2mci和13ad)，在一个样品中和在相同的样品中，进行标志物水平的复测即双测定，以便研究测量的可靠性。总pkr和ppkr446的两次连续测量之间同类相关系数的可靠值能够得到证明(分别为0.94和0.97)。

一方面，在总pkr和ppkr446水平与年龄或mmse评分之间未能建立相关性。此外，观察到，在ad个体中，ppkr446的水平在男性中比在女性升高的多。

本发明人还研究了ad和nc个体中总pkr水平、ppkr446水平、ppkr446/总pkr比与aβ42、t-tau和ptau181水平之间的相关性(表6)。

表6：总pkr水平、ppkr446水平、ppkr446/总pkr比与aβ42、t-tau和ptau181水平之间的相关性

观察到，在ad个体中，ptau181浓度与总pkr和ppkr446水平相关，但是相关系数低。另一方面，在ad个体中，在总pkr或ppkr446水平与aβ42和t-tau水平之间，未发现相关性。此外，在nc个体中，未在总pkr水平，或ppkr446水平与aβ、t-tau和ptau181水平之间证明相关性。

因此，这表明，总pkr水平、ppkr446水平，或ppkr446比提供了相对于常规csf标志物实质上是独立的信息，从而使得可能特别是预料，将总pkr水平、ppkr446水平，或ppkr446比与aβ42、t-tau和ptau181水平进行组合，会使得改善基于这些标志物的当前检测的效率成为可能。

而且，本发明人观察到，在45名ad个体中，6名个体显示了未满足aβ42、t-tau和ptau181水平的阳性标准但是表现出ppkr446水平和ppkr446/总pkr比增加的csf样品(表7)。

表7:aβ42、t-tau和ptau181水平正常的ad个体中总pkr水平、ppkr446水平和ppkr446/总pkr比的测定

t-pkr＝总pkr；ppkr＝ppkr446

因此，尽管常规生物标志物并未表现出异常，但是总pkr和ppkr446的评估可以证明所述异常，这加强了它们的优势，并证实本发明的生物标志物提供了实质上独立于常规生物标志物信息的信息。

最后，本发明人比较了mci个体中各种生物标志物的水平(表8)。

表8：遗忘型mci个体的总pkr、ppkr446水平和ppkr446/总pkr比的测定

t-pkr＝总pkr；ppkr＝ppkr446；稳定表示在研究持续期没有变成阿尔茨海默病的变化；转变表示在研究持续期变成阿尔茨海默病的变化

观察到，对于有关ppkr446水平的51.8odu的截止值而言，81.8％的遗忘型mci个体表现出异常水平的ppkr446。在为期1年的研究持续期中发展了阿尔茨海默病5名个体中，仅1名个体表现出正常的总pkr和ppkr446水平。相比之下，5名个体中仅有1名个体表现出异常的aβ42水平，且5名个体中仅有3名个体表现出异常的t-tau和ptau181水平。因此可见，对于鉴定mci个体中处于阿尔茨海默病早期无症状阶段的个体或处于在短期内发展阿尔茨海默病风险的个体而言，本发明的生物标志物比aβ42、t-tau和ptau181更灵敏。

此外，在6名稳定的mci患者中，4名mci患者表现出异常的总pkr和ppkr446水平。更长时间段的研究，会使得评估这些个体实际上是否发展了阿尔茨海默病成为可能。