本发明涉及中药成分检测领域，具体涉及一种金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定方法及金桑芪抗毒制剂质量控制方法。
背景技术：
获得性免疫缺乏综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)又称艾滋病，是由感染人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起的。目前，艾滋病主要采取“鸡尾酒疗法”即“高效抗逆转录病毒治疗”(haart)，例如：茚地那韦、扎西他滨等，此类药物易形成耐药性。中医药治疗艾滋病的优势：药源丰富、价格低廉、不易耐药、毒副作用少、能有效保护和改善免疫功能、延长生命，使患者长期带毒生存；中药的辨证论可应付艾滋病复杂多变的临床特点；中药在艾滋病检测出来时即可使用，西药需等到合适的治疗条件时才能使用，否则会因过早用药而产生耐药性为以后的治疗带来困难；因此，中药治疗艾滋病较西药更为积极。对于高效抗逆转录病毒治疗的病人可以配合中药治疗以减毒增效，增加依从性，促进免疫重建。
金桑芪抗毒制剂组方源于兰州市肺科医院感染科的验方，是在继承前贤经典方药的基础上，根据艾滋病的发病原因和致病机理，遵循中医理法和方药组方原则，参考现代中药研究成果，筛选组合而成。具有清热祛邪、扶正固本之效，能够在抑制hiv的同时，重建机体免疫体系。该方长期在我院感染科使用，作为艾滋病患者的辅助用药，具有一定的临床疗效。组方中贯叶金丝桃和桑白皮的活性成分具有抑制hiv的作用，而黄芪增强巨噬细胞吞噬能力，对机体各系统均具有正向调节和保护修复作用。
技术实现要素：
为更好的控制生产工艺、确保临床疗效，本发明旨在提供一种对各批次药品的共有峰具有良好的精密度、稳定性、重复性的金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定方法及金桑芪抗毒制剂质量控制方法。
具体地，提供一种金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定方法。
具体地，本发明的金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)所述金桑芪抗毒制剂用95％乙醇-水提取，得到供试品溶液；
(2)供试品溶液上高效液相色谱仪检测得到hplc指纹图谱，色谱条件为，色谱柱：watersxselectcsh--c18、4.6mm×150mm、5μm，检测波长：260nm，流速：1.0ml·min-1，进样量：20μl，以乙腈(a)-0.05～0.2wt％磷酸溶液(b)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为梯度洗脱0-20min，15％渐变43％a；20-38min，43％渐变80％a；38-40min，80％a。
其中，所述色谱柱watersxselectcsh--c18，4.6mm×150mm为其内径×长度、5μm为其填充物平均粒径。另外，步骤(1)中的提取方式为加热回流提取或超声波提取。
其中，步骤(1)中所述95％乙醇-水的提取液中95％乙醇与水的体积比为(30～70):(70～30)。
另外，所述95％乙醇与水的体积比优选为52.6:47.4。
此外，所述磷酸的浓度为0.1wt％。
此外，所述金桑芪抗毒制剂由以下中药材的有效成分组成：
此外，本发明还可提供一种金桑芪抗毒制剂质量控制方法，具体地，包括下述步骤：
(1)将10批次金桑芪抗毒制剂分别用95％乙醇-水提取，得到供试品溶液；
(2)精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素、甘草酸铵适量，用70％乙醇配制浓度分别为0.01188mg·ml-1毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.02546mg·ml-1芦丁、0.0788mg·ml-1甘草苷、0.0260mg·ml-1金丝桃苷、0.01428mg·ml-1槲皮素、0.0396mg·ml-1甘草酸铵混合对照品溶液；
(3)按金桑芪抗毒滴丸的处方分别制备不含贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草提取物的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液；
(4)将供试品溶液、混合对照品溶液及阴性样品溶液分别上高效液相色谱仪检测得到hplc指纹图谱，色谱条件为，色谱柱：watersxselectcsh--c18、4.6mm×150mm、5μm，检测波长：260nm，流速：1.0ml·min-1，进样量：20μl，以乙腈(a)-0.05～0.2wt％磷酸溶液(b)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为梯度洗脱0-20min，15％渐变43％a；20-38min，43％渐变80％a；38-40min，80％a；
(5)根据检测得到hplc指纹图谱，确认金桑芪指纹图谱中24个共有峰，其中1、3、5、8、9、13号峰为贯叶金丝桃提取物中成分，其中3号峰为芦丁，5号峰为金丝桃苷，13号峰为槲皮素；6、11、16、21、22、23、24号峰为桑白皮提取物中成分；2、7、10、12、18号峰为黄芪提取物中成分，其中2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4、14、15、17、19号峰为甘草提取物中成分，其中4号峰为甘草苷，19号峰为甘草酸铵；20号峰为贯叶金丝桃和甘草共有峰；
(6)在检测得到hplc指纹图谱中，根据各特征峰的保留时间及峰面积值，绘制标准金桑芪指纹图谱；
(7)将待测试金桑芪抗毒制剂样品按步骤(1)制备待测样液，并按步骤(4)的色谱条件测试指纹图谱，将该指纹图谱与标准金桑芪指纹图谱比较，相似度不低于0.95即为合格金桑芪抗毒制剂。
其中，步骤(1)中所述95％乙醇-水的提取液中95％乙醇与水的体积比为(30～70):(70～30)。
此外，所述95％乙醇与水的体积比为52.6:47.4。
此外，步骤(4)中所述磷酸溶液的浓度为0.1wt％。
另外，在本发明中，30％、50％、70％、95％乙醇均是指质量浓度。
即，本发明通过特定的色谱条件测定金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱，取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素、甘草酸铵对照品适量，用70％乙醇溶解，制成混合对照品溶液；按金桑芪抗毒制剂的中药材组成，分别制备不含有贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草的阴性样品，再用50％乙醇提取，得到阴性样品溶液；将阴性样品溶液以及混合对照品溶液用高效液相色谱仪检测，分别得到阴性样品和对照品的图谱；根据供试品、阴性样品和对照品的图谱确定hplc指纹图谱特征峰的归属。
通过对特征图谱的特征峰数据进行相似度计算，对金桑芪抗毒制剂的特征图谱与原料药材的特征图谱的相关性进行了分析，评价不同批次金桑芪抗毒制剂样品间的质量差异或控制不同批次金桑芪抗毒制剂的质量。
附图说明
图1是实施例1中10批金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱。
图2是实施例1中待测样品的hplc指纹图谱。
图3是对照品、待测样品、阴性样品的hplc指纹图谱。
具体实施方式
下述实施例只是用于说明本发明而不是限制本发明。实施例中所用的试剂和仪器如未进行特别说明，均为可从一般商业渠道获得的常规试剂和仪器。
实验例：金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定
1仪器和材料
高效液相色谱仪(waters2695，美国)，pda检测器(waters2998)；bs224s型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；kh-500de数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201505)，芦丁(批号100080-201409)，甘草苷(批号111610-201607)，金丝桃苷(批号111521-201507)，槲皮素(批号100081-201509)，甘草酸铵(批号110731-201619)均购自中国食品药品检定研究院，金桑芪抗毒制剂(兰州市肺科医院制剂室生产，批号分别为20161014、20161028、20161108、20161124、20161212、20161228、20170110、20170124、20170217、20170314)。乙腈为色谱纯试剂，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱watersxselectcsh-c18(4.6mm×150mm,5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，梯度洗脱0-20min，15％渐变43％a；20-38min，43％渐变80％a；38-40min，80％a；流速为1.0ml·min-1，检测波长260nm，进样量20μl。
2.2溶液的制备
2.2.1供试品溶液的制备
取装量差异下本品(金桑芪抗毒制剂)研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为52.6:47.4的95％乙醇与水的混合液30ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率50khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用相同体积比的95％乙醇与水的混合液补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.2阴性样品溶液的制备
按金桑芪抗毒制剂的处方分别制备不含贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草提取物的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
2.2.3对照品溶液的制备
精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素、甘草酸铵适量，分别用70％乙醇溶解，配成浓度分别为0.0494、1.273、1.970、0.100、1.190、0.198mg·ml-1的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液1000μl、100μl、200μl、1300μl、60μl、1000μl置5ml量瓶中，以70％乙醇定容，摇匀，得质量浓度分别为0.01188mg·ml-1毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.02546mg·ml-1芦丁、0.0788mg·ml-1甘草苷、0.0260mg·ml-1金丝桃苷、0.01428mg·ml-1槲皮素、0.0396mg·ml-1甘草酸铵混合对照品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1精密度试验
取同一批号金桑芪抗毒制剂供试品溶液，连续进样6次，以金丝桃苷作为参照峰，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd。结果各共有峰相对保留时间的rsd为0.038％～0.131％，相对峰面积的rsd为1.143％～1.672％，表明精密度良好。
2.3.2重复性试验
取同一批号金桑芪抗毒制剂供试品5份，每份5.0g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样检测。结果表明，各共有峰相对保留时间的rsd为0.066％～0.471％，各共有峰相对峰面积的rsd为1.212％～1.825％，表明重复性良好。
2.3.3稳定性试验
取金桑芪抗毒制剂同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd分别为0.083％～1.238％和1.463％～2.167％，表明供试品在24h内稳定。
2.4指纹图谱的建立及共有峰的指认
2.4.1指纹图谱的建立
取10批金桑芪抗毒制剂样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液按“2.1”色谱条件测定，得到10批金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱。确定了24个共有峰，且共有峰的总面积占总峰面积的90％，因此确定该24个色谱峰为金桑芪抗毒制剂的指纹图谱共有峰。
以5号峰(金丝桃苷)为参照峰，取10批金桑芪抗毒制剂指纹图谱计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，见表1和表2。结果各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd均小于3％，说明该10批金桑芪抗毒制剂样品的成分以及各成分的量都较稳定。
表110批金桑芪抗毒制剂中共有峰的相对保留时间
表210批金桑芪抗毒制剂中共有峰的相对峰面积
2.4.2各共有峰的指认
分别精密吸取金桑芪抗毒制剂供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液20μl进样测定。结果表明，10批样品特征图谱的色谱峰均在40min内全部出完，对所得特征图谱进行指认，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了24个峰。其中2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、13号峰和21号峰分别是毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素和甘草酸铵峰。
通过金桑芪抗毒制剂供试品和贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草等药材的阴性样品溶液的色谱图比较分析，确定各特征峰的药材归属。根据各共有峰的保留时间及紫外光谱信息，确认了23个特征峰的来源，其中1个峰未得到归属。在特征图谱的24个共有峰中，1、3、5、8、9、13号峰为贯叶金丝桃提取物中成分，其中3号峰为芦丁，5号峰为金丝桃苷，13号峰为槲皮素，6、11、16、21、22、23、24号峰为桑白皮提取物中成分，2、7、10、12、18号峰为黄芪提取物中成分，其中2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，4、14、15、17、19号峰为甘草提取物中成分，其中4号峰为甘草苷，19号峰为甘草酸铵。20号峰为贯叶金丝桃和甘草共有峰。
2.5样品相似度评价结果
通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版”软件，计算得出10批金桑芪抗毒制剂特征图谱的相似度(见表3)。结果显示，各批样品相似度大于0.95，且各色谱峰的保留时间匹配较好，相对保留时间和相对峰面积的rsd均小于3％。由此可知，各批次药材共有物质出峰时间大致相同，成分较稳定，含量也基本稳定。
表310批金桑芪抗毒制剂相似度评价结果
3讨论
3.1提取条件的选择
通过试验比较了超声提取和回流提取之间的差异，同时比较了不同浓度的乙醇提取(30％、50％、70％)和提取时间之间的差异。结果显示加热回流提取和超声提取的金丝桃苷含量相当。考虑到超声波提取耗能低、简便易行，故采用超声提取法。以金丝桃苷的含量为指标，得到最佳提取条件为50％的乙醇超声提取20分钟。
3.2色谱条件的选择
在流动相的选择中，以金丝桃苷的含量为考察指标，分别评价甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸等不同比例的流动相进行等度和梯度洗脱。结果显示，梯度洗脱以乙腈-0.1％磷酸最优，锋形、分离度均较好，各峰的保留时间适中，且分析时间适宜，均在40min内完成。
3.3检测波长的选择
对样品全波长扫描，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷λmax＝260nm、芦丁λmax＝257nm、甘草苷λmax＝237nm、金丝桃苷λmax＝254nm和357nm、槲皮素λmax＝257nm、甘草酸铵λmax＝237nm。提取不同吸收波长的色谱图，结果发现在260nm时，各峰吸收均较好，因此，选择最佳检测波长为260nm。
由于中药复方具有成分复杂、有效成分不确定等因素，目前中药制剂的含量测定指标如何选择一直难以统一。在质量标准的建立过程中，往往寻找含量高、易检测但可能与制剂疗效无关的化学成分作为检测指标。在选择含测指标时应综合考虑各药味所含的有效成分、特征成分、毒性成分等，建立多指标含量测定体系，本发明结合主要药效和特征成分，对金桑芪抗毒制剂建立了hplc指纹特征图谱。本发明考察了各批药品共有峰的精密度、稳定性、重复性，其rsd值和非共有峰总面积占总峰面积比值均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》要求。
下列实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1
金桑芪抗毒滴丸(由贯叶金丝桃15g、桑白皮15g、黄芪9g、甘草2g的比例组成处方药材，粉碎，过筛，混匀，按药剂学常规滴丸制备方法制得)。
1、供试品溶液的制备
取10批上述金桑芪抗毒滴丸样品，取装量差异下本品研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为52.6:47.4的95％乙醇与水的混合液30ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率50khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用相同体积比的95％乙醇与水的混合液补足减失的重量，混匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
2、对照品溶液的制备
精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素、甘草酸铵适量，分别用70％乙醇溶解，配成浓度分别为0.0494、1.273、1.970、0.100、1.190、0.198mg·ml-1的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液1000μl、100μl、200μl、1300μl、60μl、1000μl置5ml量瓶中，以70％乙醇定容，摇匀，得质量浓度分别为0.01188mg·ml-1毛蕊异黄酮葡萄糖苷、0.02546mg·ml-1芦丁、0.0788mg·ml-1甘草苷、0.0260mg·ml-1金丝桃苷、0.01428槲皮素、0.0396mg·ml-1甘草酸铵混合对照品溶液。
3、阴性样品溶液的制备
按金桑芪抗毒滴丸的处方分别制备不含贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草提取物的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
4、hplc指纹图谱的测定
hplc指纹图谱的测定：取供试品溶液上hplc仪，色谱条件：色谱柱watersxselectcsh-c18(4.6mm×150mm,5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，梯度洗脱0-20min，15％渐变43％a；20-38min，43％渐变80％a；38-40min，80％a；流速为1.0ml·min-1，检测波长260nm，进样量20μl。
分别将不含贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草提取物的阴性样品以及对照品按上述色谱条件测定色谱图，如图3所示。
5.共有峰的确定
分别精密吸取金桑芪抗毒滴丸供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液20μl进样测定(见图1、图2、图3)。结果表明，10批样品特征图谱的色谱峰均在40min内全部出完，对所得特征图谱进行指认，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了24个峰。其中2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、13号峰和21号峰分别是毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素和甘草酸铵峰。
通过金桑芪抗毒滴丸供试品和贯叶金丝桃、桑白皮、黄芪、甘草等药材的阴性样品溶液的色谱图比较分析，确定各特征峰的药材归属。根据各共有峰的保留时间及紫外光谱信息，确认了23个特征峰的来源，其中1个峰未得到归属。在特征图谱的24个共有峰中，1、3、5、8、9、13号峰为贯叶金丝桃提取物中成分，其中3号峰为芦丁，5号峰为金丝桃苷，13号峰为槲皮素，6、11、16、21、22、23、24号峰为桑白皮提取物中成分，2、7、10、12、18号峰为黄芪提取物中成分，其中2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，4、14、15、17、19号峰为甘草提取物中成分，其中4号峰为甘草苷，19号峰为甘草酸铵。20号峰为贯叶金丝桃和甘草共有峰。
6.待测样品相似度评价
将待测试金桑芪抗毒制剂样品按供试品溶液的制备方法制备待测样液，并hplc指纹图谱的测定，将该指纹图谱与标准金桑芪指纹图谱比较，相似度大于0.9，为合格金桑芪抗毒制剂。