一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒的制作方法

本实用新型涉及检测领域，特别涉及一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒。

背景技术：

肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称之为肿瘤干细胞，其被认为是造成恶性肿瘤复发的主要原因，因此肿瘤干细胞的研究是当今肿瘤领域的热点。现有的肿瘤干细胞检测手段复杂，效率低，通用性差，有的甚至对细胞有毒性。如：传统的细胞表面标志分子如CD133,CD44，CD24等可用来分离鉴定某些肿瘤的肿瘤干细胞，但是这类标志分子常常需要将几种标志分子组合在一起使用，并且这类标志分子不是肿瘤干细胞通用的标志分子；另外，Hoechst 33342也可以用来分离疑似肿瘤干细胞的侧群细胞，但Hoechst 33342染色对细胞具有毒性，且某些肿瘤中的侧群细胞并不能代表肿瘤干细胞本身。

干祖细、祖细胞和肿瘤干细胞均表达较高的乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，缩写ALDH)活性，高ALDH活性被认为几乎是所有肿瘤干细胞的通用标志，因此检测细胞内ALDH活性的试剂盒对肿瘤干细胞的研究有重要意义。另外，检测细胞内酶的反应速度很快，因此对所用检测试剂的质量要求较高，而生化检测试剂对环境变化敏感，如：运输中的温度变化和颠簸状态都容易使生化检测试剂失效，因此如何使该试剂盒中的各种试剂保持最佳性能也对肿瘤干细胞的研究有重要意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本实用新型的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本实用新型提供了一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒，其内部结构使置于其中的特定试剂均能保持最佳性能且便于运输。

本实用新型具体提供了以下技术方案：

一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒，包括试剂盒本体，所述试剂盒本体内设置有：

第一储存区域，所述第一储存区域内设置有干冰和第一试剂容器，并且所述干冰包围在第一试剂容器外，所述第一试剂容器中储存有未活化的乙醛脱氢酶底物氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇(简称为BAAA-DA)；和

第二储存区域，所述第二储存区域内设置有冰袋、第二试剂容器和第三试剂容器，并且所述冰袋包围在第二试剂容器和第三试剂容器外，所述第二试剂容器中储存有乙醛脱氢酶特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛(简称为DEAB)，所述第三试剂容器中装有试验缓冲液，所述试验缓冲液是含有盐酸维拉帕米和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述第二储存区域还设置有第四试剂容器，所述第四试剂容器被冰袋包围，且第四试剂容器中储存有HCl。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述干冰外设置有干冰袋。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述第一试剂容器、第二试剂容器和第四试剂容器中的一种或多种为棕色玻璃瓶。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述第三试剂容器为棕色塑料瓶。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述未活化的乙醛脱氢酶底物氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇为浓度0.6-1.2g/L的氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇溶液。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述乙醛脱氢酶特异性抑制剂二乙氨 基苯甲醛为浓度1.2-1.8mM的二乙氨基苯甲醛溶液。

上述试剂盒在另一种实施方式中，所述试验缓冲液是含有浓度45-55μM盐酸维拉帕米和浓度0.8-1.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：

1、本实用新型试剂盒设置了两个储存区域，第一储存区域中的干冰可以吸收大量的热量使环境温度保持极低，适用于对温度特别敏感的试剂，第二储存区域中的冰袋也可以使置于其中的试剂保持低于室温的温度，本实用新型针对氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇、二乙氨基苯甲醛、盐酸维拉帕米和牛血清白蛋白的性质选择了不同的储存区域，使这些试剂都能保持最佳性能。

2、干冰和冰袋包围在试剂容器周围，可以相对固定试剂容器的位置，减轻试剂容器的颠簸状态。

3、HCl是用来活化氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇的，在本实用新型试剂盒中设置HCl可以方便使用者直接使用，无需额外配制。

附图说明

图1是本实用新型试剂盒的结构示意图；

图2是本实用新型试剂盒的工作原理示意图；

图3是本实用新型试剂盒使用时的实验流程图；

其中：1-试剂盒本体，2-第一储存区域，21-干冰，22-第一试剂容器，3-第二储存区域，31-冰袋，32-第二试剂容器，33-第三试剂容器，34-第四试剂容器。

具体实施方式

下面结合附图，对本实用新型的一个具体实施方式进行详细描述，但应 当理解本实用新型的保护范围并不受具体实施方式的限制。

以下实施例提到的试剂均可通过商业渠道购买，氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇(BAAA-DA)购自Cayman Chemical公司,Item Number 9002056；4-二乙氨基苯甲醛(DEAB)购自Sigma公司；盐酸维拉帕米购自Shanghai Sphchem Co.Ltd(CAS:52-53-9)；牛血清白蛋白购自MP Biomedicals。

实施例1 试剂盒结构

如图1所示，一种检测细胞内ALDH活性的试剂盒，包括试剂盒本体1，所述试剂盒本体1内设置有：

第一储存区域2，所述第一储存区域2内设置有干冰21和第一试剂容器22，并且所述干冰21包围在第一试剂容器22外，所述第一试剂容器22中储存有未活化的乙醛脱氢酶底物氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇；和

第二储存区域3，所述第二储存区域3内设置有冰袋31、第二试剂容器32和第三试剂容器33，并且所述冰袋31包围在第二试剂容器32和第三试剂容器33外，所述第二试剂容器32中储存有乙醛脱氢酶特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛，所述第三试剂容器33中装有试验缓冲液，所述试验缓冲液是含有盐酸维拉帕米和牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

上述试剂盒设置了第一储存区域2和第二储存区域3，第一储存区域2中的干冰21可以吸收大量的热量使环境温度保持极低，适用于对温度特别敏感的试剂，第二储存区域3中的冰袋31也可以使置于其中的试剂保持低于室温的温度，本实用新型针对氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇、二乙氨基苯甲醛、盐酸维拉帕米和牛血清白蛋白的性质选择了不同的储存区域，使这些试剂都能保持最佳性能。

另外干冰21和冰袋31包围在试剂容器周围，可以相对固定试剂容器的位置，减轻试剂容器的颠簸状态。

优选的，所述第二储存区域3还可以设置有第四试剂容器34，所述第四 试剂容器34被冰袋31包围，且第四试剂容器34中储存有HCl。

HCl是用来活化氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇的，在上述试剂盒中设置HCl可以方便使用者直接使用，无需额外配制。

优选的，所述干冰外设置有干冰袋。

设置干冰袋方便使用者取出第一试剂容器21。

优选的，所述第一试剂容器21、第二试剂容器32和第四试剂容器34中的一种或多种可以为棕色玻璃瓶。

优选的，所述第三试剂容器33为棕色塑料瓶。

优选的，所述未活化的乙醛脱氢酶底物氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇为浓度0.6-1.2g/L的氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇溶液。

优选的，所述乙醛脱氢酶特异性抑制剂二乙氨基苯甲醛为浓度1.2-1.8mM的二乙氨基苯甲醛溶液。

优选的，所述试验缓冲液是含有浓度45-55μM盐酸维拉帕米和浓度0.8-1.2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

优选的，氟硼二吡咯类荧光染料-氨基乙醛缩二乙醇溶液的包装体积为50μL/瓶；二乙氨基苯甲醛溶液的包装体积为1mL/瓶；试验缓冲液为4瓶，每瓶的包装体积为25mL；所述HCl的包装体积为1.5mL。

实施例2 检测细胞内ALDH活性的试剂盒的原理和使用方法

一、原理部分

检测细胞内ALDH活性试剂盒的工作原理如图2所示，具体为：活化的BAAA-DA(即BAAA)是一个无毒性的ALDH底物，它可以自由扩散至完整的活细胞内；在细胞内存在ALDH的情况下，BAAA被转化成荧光产物BODIPY-aminoacetal(BAA)，在底物BAAA足量的情况下，荧光产物BAA的量与ALDH活性呈正相关，细胞内的荧光产物BAA可以通过流式细胞仪绿色 荧光通道(520-540nm)被检出。虽然BAA能通过ATP-binding cassette(ABC)转运系统主动外泄出细胞外，但优化过的试验缓冲液具有抑制该外泄的功能。Diethylaminobenzaldehyde(DEAB)是ALDH的特异性抑制剂，将DEAB加入对照管抑制ALDH作用于BAAA，用来控制背景荧光。细胞内ALDH活性检测试剂盒结合流式细胞仪可以用于正常干祖细胞、正常祖细胞或者肿瘤干细胞的研究中。

二、使用方法部分

1、用试验缓冲液将样品细胞稀释成细胞浓度为1×10⁶个/ml的单细胞悬液；但要注意：当样品细胞的来源为血液样本时，若红细胞和白细胞的细胞数量比例大于2：1，要在样品细胞中加入不含表面活性剂和固定剂的红细胞裂解液裂解红细胞至红细胞和白细胞的细胞数量比例不大于2：1，然后250g离心5分钟，去除上清，再用试验缓冲液稀释沉淀物，使细胞浓度为1×10⁶个/ml；

2、为每个待检测的样品细胞取出两个流式检测管，其中一个流式检测管作为检测管，另一个流式检测管作为对照管，试剂的加入方式可以参考图3进行，具体为：

A、在检测管中加入1ml步骤1所得细胞悬液；之后向检测管中加入5μL活化稀释好的BAAA-DA溶液(参见“试剂的准备”部分步骤3)，混匀；

B、向对照管中加入5μL 1.5mM DEAB乙醇溶液，立即盖上对照管的盖子和盛放DEAB乙醇溶液的容器盖子，防止DEAB随着乙醇挥发；

C、将0.5ml步骤A所得混合液立即转移至已加入DEAB的对照管中混匀；由于步骤A中底物BAAA-DA一旦加入到细胞悬液，ALDH酶反应便立即开始，所以0.5ml步骤A所得混合液要迅速的加入到含有DEAB的对照管中；

在对照体系和反应体系的构建中，还可以是先添加其他组分，最后再向检测管和对照管中加入底物BAAA-DA，但要保证对照体系和反应体系各组分的添加量与步骤A-C中描述的相同；

3、将检测管和对照管在37℃孵育30-60分钟；

4、将检测管和对照管在250g的条件下离心5分钟，取出上清，将细胞沉淀重悬于0.5ml试验缓冲液中，冰上或者4℃存放；

额外的，如果要检测细胞的免疫表型，则需要在步骤4后孵育抗体，为了防止反应底物BAAA-DA的流出，抗体的孵育要在分析缓冲液中进行。

额外的，步骤4后可以选择性的进行细胞活力的检测，如果活细胞少于90％，建议使用DNA染料，如propidium或者7-actinoaminomycin-D进行细胞染色；

5、对经过上述处理的样品细胞进行流式细胞仪检测，具体步骤如下：

1)创建一个横坐标为前向角散射(FSC)、纵坐标为侧向角散射(SSC)的点图，称之为FSC vs SSC点图；

2)在设定模式，先检测对照管：调整FSC及SSC的电压使有核细胞聚集到FSC vs SSC点图中央，并在FSC vs SSC点图创建一个R1门使有核细胞落入其中并将细胞碎片划到区域外，R1门的创建可参考图3中封闭区域；

3)在R1区域的设门基础上，创建一个横坐标为荧光通道1信号(FL1)、纵坐标为侧向角散射(SSC)的点图，称之为FL1vs SSC点图；

4)在FL1vs SSC点图上，调整FL1光电倍增管电压使得对照管的点群右边界位于FL1荧光强度的横坐标中间位置附近，；

5)之后换上与对照管对应的检测管，创建一个R2门，使R2门包含所有的ALDH阳性(ALDHbr)细胞群，换对照管；

6)进行数据收集：在设置中移除自动分析，在对照管和检测管的R1门中均收集100000个细胞。

不同种类的样品细胞有不同的SSC，因此划门也要依照上述原则进行调 整，R2门划分所得区域不同。ALDH阳性细胞的比例以及背景荧光强度都取决于样品细胞的类型，为每一个样本添加独立的对照来确保分析的准确性。

试剂盒的各种组分的浓度和配比经过精心的优化，利用流式细胞仪可简单、快速的检测细胞内ALDH活性，检测时对照管细胞的荧光显示区域更集中，使得样品管细胞的荧光显示不容易被对照管细胞的荧光显示所覆盖，试验操作者更容易观察到样品管细胞的荧光显示，使该检测更为灵敏；同时使用该检测试剂盒对细胞无毒、无伤害，将检测过的细胞从试验缓冲液中分离后，BAAA和ALDH产生的荧光物质BAA可以通过ABC转运系统排出细胞外，因此经过分离的细胞可直接用于体内外实验；并且试验缓冲液中1％BSA还具有保护细胞的功能。

以上公开的仅为本实用新型的具体实施例，但是，本实用新型并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本实用新型的保护范围。