一种用于检测细胞角蛋白19片段的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种用于检测细胞角蛋白19片段（cyfra21-1）的试剂盒。

背景技术：

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位，而其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。细胞角蛋白19片段（cyfra21-1）目前被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,nsclc)的诊断具有重要价值。

细胞角蛋白19片段（cyfra21-1）是细胞角蛋白19的水溶性片段，因其可特异性的与两株单克隆抗体bm19.21和ks19.1结合，故称为cyfra21-1。在恶性上皮细胞中，细胞角蛋白19经常被降解为多个片段，并释放进入血液循环中，故在临床血清检测中，cyfra21-1常被认为是细胞角蛋白19的有效检测片段。如果肺部存在不清晰的环形阴影，同时血清cyfra21-1浓度>30ng/ml，原发性支气管肺癌的可能性非常高。cyfra21-1的血清浓度水平高低与肿瘤临床分期正相关，也可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发的有效指标，其在各类非小细胞肺癌阳性检出率为70%～85%。cyfra21-1的血清高浓度水平提示疾病处于进展期和预后不良。治疗成功的标志是cyfra21-1的血清浓度迅速下降，反之则表示病灶未完全清除。血清水平下降后又升高，则提示疾病复发。

目前市场上用于检测细胞角蛋白19片段的产品（如北京华科泰、天津博奥塞斯、北京科美等）普遍存在向包被板微孔中加入样本后裸眼识别不明显，操作者有时不能准确判断微孔中是否加入待测样本的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的缺陷，提供一种用于检测细胞角蛋白19片段的试剂盒，该试剂盒可在加入待测物后易于操作者裸眼观察，避免了重复加样。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的用于检测细胞角蛋白19片段的试剂盒，包括样品稀释液，所述样品稀释液的组分包括10~200mmol/l的缓冲液，0.1~0.5%的防腐剂，1~5%的蛋白质类稳定剂，5~10%的糖类稳定剂，1~5%的edta,0.1~0.5%的表面活性剂。

实际配制时，所述缓冲液采用ph6~8的mes缓冲液。

所述防腐剂可使用proclin300、mit、bro、ipbc或nan3中的一种或两种以上的混合物。

所述蛋白质类稳定剂可使用酪蛋白、鱼明胶或牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。

所述糖类稳定剂可使用蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种或两种以上混合物。

所述表面活性剂可使用tritonx-100、tween20、tween60或辛基酚聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。

所述edta可单独使用乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸二钾，也可以将二者混合使用。

本发明的优点在于样品稀释液在加样后会明显改变颜色，使得操作者在加入待测物后试剂颜色会立刻发生明显变化，易于裸眼观察，从而避免重复加样。本发明试剂盒与市场现有同类产品相比具有更宽的线性范围，且反应过程无需加热，室温震荡即可充分反应。

附图说明

图1是本发明试剂盒加入样本前后的颜色对比。

图2是本发明试剂盒与标杆产品临床相关性对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明实施例中所用的检测试剂和仪器为本领域市售产品，检测方法为本领域常规方法。

实施例1制备用于检测细胞角蛋白19片段的试剂盒

本发明试剂盒包括包被板、酶结合物、发光底物a、发光底物b、样品稀释液、洗液、子母袋、板贴，其中的样品稀释液采用以下方法配制：

称取mes0.65g（北京益利精细化学品有限公司）、氯化钠0.8g（北京益利精细化学品有限公司）、乙二胺四乙酸二钠（edta）（北京益利精细化学品有限公司）2g，加入80ml纯化水，调节ph至6~8，加入鱼明胶3g（sigma）、proclin3000.2ml（sigma）、mit0.2ml，海藻糖2g(杭州四季青生物工程材料有限公司)、tween600.2ml（sigma），然后定容至100ml，搅拌至溶解，得到的100ml样品稀释液可在2-8℃条件下保存18个月。

实施例2本发明试剂盒加入样本前后颜色变化情况

将本发明试剂盒按常规方法使用，当加入样本后，其颜色发生了明显的变化，如图1所示，空白微孔板（最左侧的四列）中加入样品稀释液（中间四列，颜色为浅蓝色），当加入样本后（右侧四列），颜色很明显变为浅绿色，由于颜色变化显著，裸眼识别明显，操作者能准确判断微孔中是否已加入待测样本，杜绝了重复加样或未加样现象的发生。

实施例3本发明试剂盒与rochediagnosticsgmbh公司生产的非小细胞肺癌相关抗原21-1定量测定试剂盒（电化学发光法）（以下简称“标杆产品”）临床符合率对比

采用本发明试剂盒和标杆产品的同类试剂盒同时考核509例临床样本，具体数据见下表1：

表1

从表1结果看出，本发明试剂盒与标杆产品（罗氏）阳性符合率（灵敏度）达99.26%、阴性符合率（特异性）达98.10%，总符合率高达99.02%，具体见表1本发明试剂盒与标杆产品临床符合率。考核的509例临床样本中除4例超过线性范围上限（150ng/ml）的样本外，其他505例样本本发明试剂盒与标杆产品相关性r=0.9943，具体见附图2。

说明本发明试剂盒有较好的临床灵敏度和特异性，能够满足市场需求。

实施例4本发明试剂盒在不同温度下的反应情况

使用本发明试剂盒在不同温度下（15℃、20℃、25℃、28℃）同时考核47例临床样本，结果见下表2。

表2

表2结果表明，在15-28℃范围内结果无明显差别。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种用于检测细胞角蛋白19片段的试剂盒，包括包被板、酶结合物、发光底物A、发光底物B、样品稀释液、洗液、子母袋、板贴，其中样品稀释液的组分包括10~200mmol/L的缓冲液，0.1~0.5%的防腐剂，1~5%的蛋白质类稳定剂，5~10%的糖类稳定剂，1~5%的EDTA,0.1~0.5%的表面活性剂。本发明的优点在于样品稀释液在加样后会明显改变颜色，使得操作者在加入待测物后试剂颜色会立刻发生明显变化，易于裸眼观察，从而避免重复加样。本发明试剂盒与市场现有同类产品相比具有更宽的线性范围，且反应过程无需加热，室温震荡即可充分反应。

技术研发人员：刘雅奇;渠文涛;史小芹;马雷;周金龙;付光宇;吴学炜
受保护的技术使用者：郑州安图生物工程股份有限公司
技术研发日：2018.09.27
技术公布日：2019.01.15