一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用与流程

本发明属于电化学免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用。

背景技术：

阿尔茨海默症（alzheimer’sdisease,ad）是一种以认知障碍和行为损害为主要特征的神经退行性疾病，是老年痴呆症最常见的一种形式，约占老年痴呆症的50-60%。临床表现为记忆功能减退、语言障碍、智力低下、思维迟钝等症状，严重时甚至会导致死亡。ad是一个非常复杂的疾病，通常情况下没有明显的遗传学特征，似乎年龄是其主要的危险因素。ad在诊断上的复杂性决定了它在临床上有一个很宽泛的界定，一些外部环境因素和内部基因因素会进一步加重病情。外在的因素主要有脑外伤、抽烟、肥胖、糖尿病、高血压以及高金属离子含量等。内部基因因素主要有早老素基因突变，apoe4基因多态性，编码凝集素和网格蛋白的基因等。研究发现，含有apoe4基因的人患阿尔茨海默症的风险较不含该基因的人高3～10倍，此外有研究发现，apoe4蛋白还具有促进aβ肽聚集和抑制aβ肽降解酶活性的作用，由此可见，apoe4蛋白与阿尔茨海默症的发病有重要关系。因此，检测血液中的apoe4蛋白含量对阿尔茨海默症的预防与早期诊断有重要的意义。

检测血液中的apoe4蛋白对阿尔茨海默症的预防以及早期诊断有重要意义。目前对阿尔茨海默症标志物的检测方法有很多，如放射免疫分析法、电化学发光法、比色法等等，但多数检测方法繁琐、操作复杂、费用昂贵或检测限高，因此建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。

目前电化学免疫传感器已经广泛用于疾病标志物的检测，双抗夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性免疫分析技术和高灵敏、速度快的电化学分析技术的优势，兼具了高灵敏度、高特异性、检测速度快等优点，在临床检测、环境检测、食品安全控制以及生物分析等领域都有重要的应用价值。

本发明构建的电化学免疫传感器是基于电信号强弱确定标志物浓度的一类检测装置，具有以下优点：其一是采用简单、快速、有效的方法捕获抗体固定在电极表面；其二是利用检测抗体修饰aupd-pda纳米材料，进一步放大信号。

金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯量子点表面，大大增加了基底材料的比较面积，可以显著提高捕获抗体的固载量，并有效加速电极界面的电子传递速率；同时，aupd-pda纳米结构本身具有很好的过氧化氢催化性能，与检测抗体结合后，大大提高了检测信号，从而应用于阿尔茨海默症标志物的灵敏检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器、其制备方法及应用。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种aupd-pda纳米结构，通过下述步骤制得：

（1）取zno纳米棒超声分散于tris-hcl缓冲液中，随后加入多巴胺盐酸盐，60±5℃搅拌3.5~4.5h；离心分离，收集固体得到zno@pda纳米棒；最后，将zno@pda纳米棒分散于超纯水中，加入nh4cl溶液60±5℃搅拌0.5~1.5h用以刻蚀zno纳米棒，得到pda纳米管，zno纳米棒与多巴胺盐酸盐的质量比为1:1；

（2）将0.4-2mlhaucl4和0.1-0.5mlh2pdcl4加入煮沸的pda纳米管水溶液中，搅拌，然后加入抗坏血酸溶液，反应50~70分钟后，离心分离，收集固体得aupd-pda纳米结构。

其中，所述zno纳米棒的具体制备过程如下：将硝酸锌和氢氧化钠溶解在30ml超纯水中，使得硝酸锌的浓度为0.5m，氢氧化钠浓度为10m；然后依次加入25ml乙醇和5ml乙二胺；然后180℃水热反应20h，收集固体，即得。

进一步地，所述步骤（1）中zno纳米棒的用量为10mg，tris-hcl的浓度为10mm、用量为20ml，nh4cl溶液的浓度为0.1m，用量为10ml。

一种利用上述aupd-pda纳米结构制备检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的方法，制备步骤如下：

（1）将apoe4检测抗体与aupd-pda纳米结构混合，超声50~70min后，离心分离，可得检测抗体修饰的aupd-pda纳米结构，分散至pbs缓冲液，记为ab2-aupd-pda溶液，备用；

（2）铂碳电极的预处理：通过电沉积的方法将氧化石墨烯量子点沉积到铂碳电极表面得到一层氧化石墨烯颗粒；

（3）然后通过电泳沉积的方法将金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯颗粒上，用超纯水冲洗后，晾干；

（4）步骤（3）得到的电极表面滴加捕获抗体，孕育，然后用超纯水冲洗后，晾干；

（5）滴加的bsa溶液封闭非特异性结合位点，孕育，然后用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（6）滴加0.01-20000ng/ml的疾病标志物apoe4溶液，孕育，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（7）将ab2-aupd-pda溶液滴涂于电极表面，孵化，用超纯水冲洗电极表面后，晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。

所述金双锥包铂纳米结构，通过下述步骤制得：

种子生长法制备金纳米双锥溶液，将2ml的金纳米双锥溶液离心，将沉淀分散于2ml、0.08mctac中，依次加入10μl、0.01magno3、5μl、0.1m抗坏血酸后混匀，60℃摇床放置5小时，离心后，分散于2ml、0.005mctab中，再依次加入2-30μl、0.001mh2ptcl4、2-30μl、0.01m抗坏血酸混匀后，搅拌反应8~12h，离心后，分散于2ml水中可得金双锥包铂纳米结构。

进一步地，步骤（1）的具体过程如下：将100μl、1mg/mlapoe4的检测抗体与1ml、1mg/mlaupd-pda纳米结构混合，超声1h后，离心分离，可得检测抗体修饰的aupd-pda纳米结构，分散到1ml、10mmpbs缓冲液中，备用。

进一步地，步骤（2）中氧化石墨烯量子点的浓度为1mg/ml，在-2.8v沉积5min；所述步骤（3）中在-1.0v沉积15min；所述步骤（4）中捕获抗体的浓度为100μg/ml，用量为10μl，所述步骤（5）中bsa溶液浓度为1mg/ml、用为10μl；所述步骤（6）疾病标志物抗原溶液的用量为5μl，所述步骤（7）中ab2-aupd-pda溶液浓度为100μg/ml，用量为5μl。

进一步地，所述孕育或孵化是指在37℃保持1h，所述，晾干是在4℃冰箱中进行。

上述方法制得的检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器。

上述电化学免疫传感器在检测阿尔茨海默症标志物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在20ml、10mm的ph为5.5-7.8的磷酸缓冲液中进行测试；

（2）用时间-电流法检测过氧化氢的电流响应值，输入电压为-0.2v，取样间隔为0.1s，运行时间600s；

（3）当背景电流稳定后，每隔50s向20ml、10mm的ph为5.5-7.8的磷酸缓冲液中滴入20μl1m的过氧化氢溶液，记录电流变化。

本发明的有益成果：

①本发明制备的金双锥包铂纳米结构时在金纳米双锥的表面包覆了大量的铂颗粒，大大增加了金双锥本身的比较面积，具有强大的电子传输能力，同时能有效的与抗体结合，实现捕获抗体的固载；金双锥包铂这种大表面积的纳米结构，对于提高传感器的灵敏度具有重要意义。

②本发明用aupd-pda纳米结构连接检测抗体，一个aupd-pda分子能同时连接多个检测抗体，从而进一步提高检测的灵敏度和检测限。

③检测抗体无需标签，aupd-pda本身能有效的催化过氧化氢分解，可直接作为检测标签；避免因酶失活而引起的检测误差。

④本发明制备的双抗夹心型电化学免疫传感器对阿尔茨海默症标志物载脂蛋白e4的检测范围为0.1ng/ml-2μg/ml，检测限为0.03ng/ml。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的金纳米双锥的扫描电镜照片；

图2为本发明实施例1制备的金双锥包铂的扫描电镜照片；

图3为本发明实施例1制备的aupd-pda纳米结构的电镜照片；

图4为本发明实施例制备的传感器的检测性能分析图（即标准曲线）；

图5为本发明实施例制备的传感器的特异性分析图。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：

1、金双锥包铂纳米结构的制备

首先用种子生长法制备金纳米双锥，具体步骤如下：

种子溶液的制备：

向9.625ml超纯水中依次加入250μl柠檬酸钠（0.01m）、125μlhaucl4(0.01m)、150μlnabh4(0.01m)搅匀，室温放置两小时后使用；

生长溶液制备：向40mlctab（0.1m）溶液中依次加入2mlhaucl4(0.01m)、0.4mlagno3(0.01m)、0.8mlhcl（1m）、0.32ml抗坏血酸（0.1m）；

将0.5ml的种子溶液加入9.5ml生长溶液中，搅拌30秒，室温过夜；

离心分离，将沉淀分散于10mlctab溶液(0.01m)中，得到金纳米双锥（aubp），如图1所示，得到的金纳米双锥大小均匀，尺寸约为100nm。

将2ml的aubp用离心机7000rpm离心8分钟，将沉淀分散于2mlctac（0.08m）中，依次加入10μlagno3(0.01m)、5μl抗坏血酸（0.1m）后混匀，60℃摇床放置5小时，离心后，分散于2mlctab（0.005m）中，再依次加入2μlh2ptcl4(0.001m)、2μl抗坏血酸（0.01m）混匀后，过夜。

4000rpm离心后，分散于2ml水中可得金双锥包铂纳米结构，如图2所示，在金纳米双锥表面包覆了一层铂纳米颗粒，整体大小约为125nm。

2、检测抗体修饰的aupd-pda纳米材料（ab2-aupd-pda）的制备

聚多巴胺（pda）纳米管的制备：将一定量的硝酸锌(zn(no3)2)和氢氧化钠(naoh)溶解在30ml超纯水中，使得硝酸锌的浓度为0.5m，氢氧化钠浓度为10m；然后依次加入25ml无水乙醇(c2h5oh)和5ml乙二胺(c2h4(nh2)2)；然后180℃水热反应20h，收集白色粉末。然后取10mgzno纳米棒（上述白色粉末）超声分散于20mltris-hcl(10mm,ph8.5)缓冲液中，随后加入10mg多巴胺盐酸盐，60℃搅拌4h。离心分离，收集灰色的zno@pda纳米棒，超声分散于10ml超纯水中，得到zno@pda纳米棒水溶液。最后，向10mlzno@pda纳米棒水溶液中加入1mlnh4cl（0.1m）刻蚀zno纳米棒（即在60℃搅拌1h），2000rpm离心后分散到10ml超纯水中，可得pda纳米管溶液。

aupd-pda纳米结构的制备：将0.4mlhaucl4和0.1mlh2pdcl4加入10ml煮沸的pda纳米管水溶液中，搅拌10分钟，然后加入0.5ml抗坏血酸（0.01m），搅拌反应60分钟后，离心分离可得aupd-pda纳米结构，如图3所示，在pda纳米管上附着着大量的金钯合金，单个金钯合金颗粒的大小从十几纳米到几十纳米不等，将aupd-pda分散于10ml超纯水中，得到1mg/ml溶液，备用。

将100μlapoe4的检测抗体（1mg/ml，厂家novus，型号：nbp1-49529h）与1mlaupd-pda纳米结构（1mg/ml）混合，超声1h后，离心分离，可得检测抗体修饰的aupd-pda纳米结构，将之分散到1mlpbs缓冲液（10mm）中，ab2-aupd-pda浓度为100μg/ml，记为ab2-aupd-pda溶液，备用。

3、电化学免疫传感器的制备

（1）铂碳电极的预处理：通过电沉积的方法将氧化石墨烯量子点(1mg/ml，南京先锋纳米材料科技有限公司，货号100082)沉积到铂碳电极表面（-2.8v，5min）得到一层氧化石墨烯颗粒；

（2）然后通过电泳沉积的方法（-1.0v，15min）将步骤1制得的金双锥包铂纳米结构沉积在氧化石墨烯颗粒上，用超纯水冲洗后，4℃冰箱里晾干；

（3）继续在电极表面滴加10μl捕获抗体（ab1，100μg/ml，厂家abcam，型号：ab1907），37℃，孕育1h，然后用超纯水冲洗后，4℃冰箱里晾干；

（4）滴加10μl1mg/ml的bsa溶液，封闭非特异性结合位点，37℃，孕育1h，然后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱里晾干。

（5）滴加5μl0.01-20000ng/ml的疾病标志物载脂蛋白e4(厂家：北京拜尔迪生物技术有限公司；型号：350-04，配制系统浓度的抗原溶液时以10mm的ph为7.4的磷酸缓冲液为溶剂)，37℃，孕育1h，用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱里晾干；

（6）将步骤2中配制的ab2-aupd-pda溶液（100μg/ml）5μl滴涂于电极表面，37℃，孵化1h，用超纯水冲洗电极表面后，在4℃冰箱中晾干，制得一种检测阿尔茨海默症标志物的电化学米免疫传感器。

实施例2

阿尔茨海默症标志物apoe4的检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极（实施例1中步骤（5）中疾病标志物载脂蛋白e4溶液浓度为1ng/ml），在20ml、10mm的ph为7.4的磷酸缓冲液中进行测试；

（2）用时间-电流法检测过氧化氢的电流响应值，输入电压为-0.2v，取样间隔为0.1s，运行时间600s；

（3）当背景电流稳定后，每隔50s向20ml、10mm的ph为7.4的磷酸缓冲液中滴入20μl1m的过氧化氢溶液，记录电流变化。

实施例3

制备传感器的性能分析

为了评估所制备电化学免疫传感器的性能，对以ph为7.4的磷酸缓冲液配制的不同浓度的apoe4标准品（浓度依次为0.1、1、10、100、1000、10000、20000ng/ml）制备不同的免疫传感器进行分析。通过时间电流法测试不同浓度标准品对应的电流变化值，并绘制标准曲线，（如图4所示，δi=18.191lgc+200.78;r²=0.9841）如图4所示。本发明的传感器对阿尔茨海默症标志物apoe4检测的检测限为0.03ng/ml(s/n性噪比为3)，线性范围0.1ng/ml-2μg/ml。

实施例4

制备传感器的特异性分析

将牛血清白蛋白（bsa，10μm）、磷酸缓冲液（pbs，10μm）、载脂蛋白e2（10μm）、载脂蛋白e3（10μm）以及10nm的载脂蛋白e4按照实施例的方法分别制备成不同的免疫传感器并均采用实施例2中的方法进行测定。结果如图5所示，由图5可知，在待测物apoe4浓度远低于其他样品时，其信号仍远高于其他样品。说明，本发明制备的传感器具有良好的特异性。