一种外周血CTC的捕获方法和检测方法与流程

本发明涉及体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种外周血ctc的捕获方法和检测方法。

背景技术：

循环肿瘤细胞(ctc)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，其中极少数未被免疫系统清除的肿瘤细胞通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在适宜条件下发展为转移灶，导致肿瘤患者出现术后复发和远处转移。ctc检测对肿瘤的早期发现、辅助诊断、疗效评价、转移与复发的检测、预后判断以及个体化治疗均具有积极的临床指导意义。

由于外周血中ctc数量极少，仅占外周血白细胞的1/10⁷～1/10⁶，并且具有很强的异质性和不连续性，因此ctc的检测一直备受挑战。现有的ctc分离、捕获和富集主要有两类方法。第一类基于细胞密度，ctc与白细胞沉降系数密度不同，可采用密度梯度法进行分离，但该类方法灵敏度和特异性均较低，ctc微栓也可能由于沉降入红细胞层而丢失；第二类基于细胞大小，ctc的直径显著大于正常白细胞，通过膜滤过分离ctc，但该类方法获得的ctc纯度不高，且体积小的ctc有漏检的可能，造成假阴性。此外，现有的ctc分离方法在捕获肿瘤细胞后，容易对其造成机械伤害，从而对后续的检测和培养造成影响。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种外周血ctc的捕获方法。该捕获方法灵敏度高，特异性强，有效解决了ctc异质性导致的漏捕问题，同时也极大降低了捕获过程中对ctc的机械损伤。

本发明的第二目的在于提供一种外周血ctc的检测方法。该检测方法通过固定，染色和镜检，可以实现ctc的高效检测，避免了细胞的脱落。

本发明是这样实现的：

一种外周血ctc的捕获方法，具体包括如下步骤：将从外周血分离得到的白细胞与标记有第一亲和物的特异性抗体混合，得到第一混合液；

往第一混合液中加入标记有第二亲和物的磁性体，得到第二混合液；

将第二混合液置于磁性分离器上分离出带有磁性体的循环肿瘤细胞；

其中，第二亲和物可特异性结合第一亲和物，特异性抗体可特异性结合循环肿瘤细胞；优选地，第一亲和物为生物素，第二亲和物为亲和素；

优选地，磁性体为磁珠或带磁性的微球；

特异性抗体为epcam抗体，her2抗体，vegfa抗体和pd-l1抗体，egfr抗体，erbb2抗体，ms4a1抗体，csv抗体，叶酸受体中的任意一种及其混合物，优选的，特异性抗体为epcam抗体和her2抗体中的任意一种及其混合物。当特异性抗体为epcam抗体和/或her2抗体时，捕获效率最好。

在本发明应用较佳的实施例中，上述通过如下方法从外周血中分离得到白细胞：将全血与红细胞裂解液混合，第一次离心，收集白细胞沉淀，再在白细胞沉淀中加入红细胞裂解液，第二次离心，收集白细胞沉淀；

在第一次离心时，全血与红细胞裂解液的体积比为1-1.2:3-3.2，在第二次离心时，白细胞沉淀与细胞裂解液的体积比为1-1.2:2-2.2。通过去除红细胞可以减少红细胞对于富集循环肿瘤细胞的干扰。

在本发明应用较佳的实施例中，通过密度梯度离心法从外周血中分离得到白细胞，密度梯度离心法具体包括：将全血与生理盐水混合，置于分离介质上，离心收集白细胞；

分离介质为聚蔗糖、葡聚糖或者硅化聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种。实际使用时可以将分离介质分散于盐类混合物中。通过密度梯度离心可以实现血液中不同细胞的分层，自上而下依次为血浆层，白色淋巴细胞层，分离液层和红细胞层，其中循环肿瘤细胞处于白色淋巴细胞层。通过收集白色淋巴细胞层，可以便于后续进行磁性分离循环肿瘤细胞和白细胞。

在本发明应用较佳的实施例中，将白细胞与标记有第一亲和物的特异性抗体混合得到第一混合液具体包括：用bsa缓冲液重悬白细胞，再与标记有第一亲和物的特异性抗体混合，低速混匀孵育，离心收集白细胞沉淀，得到第一混合液；

低速混匀孵育的时间为10-60min。

通过白细胞与第一亲和物混合孵育可以使特异性抗体识别循环肿瘤细胞表面的特异性抗原，从而使第一亲和物结合至循环肿瘤细胞膜上，以利于下一步通过第一亲和物和第二亲和物的亲和作用将磁性物质结合到肿瘤细胞上。

在本发明应用较佳的实施例中，上述标记有第一亲和物的特异性抗体为生物素epcam抗体，生物素her2抗体，生物素vegf抗体，生物素pd-l1抗体，生物素egfr抗体，生物素erbb2抗体，生物素ms4a1抗体，生物素csv抗体，生物素叶酸受体中的任意一种或多种抗体的混合物。通过白细胞与多种抗体同时孵育，可以避免ctc异质性引起的漏捕，从而极大增加了ctc细胞的捕获效率。

在本发明应用较佳的实施例中，上述将第一混合液中加入标记有第二亲和物的磁性体后，低速混匀孵育，得到第二混合液，再通过磁性分离分离出带有磁性体的循环肿瘤细胞，磁性分离的次数为1-5次。

通过第一亲和物和第二亲和物的亲和作用，将磁性物质结合到肿瘤细胞上，从而使肿瘤细胞带有磁性以利于下一步的肿瘤细胞与白细胞的分离。通过反复磁性分离，可以将白细胞去除。通过磁性分离，可以极大减少对ctc细胞的机械损伤，保证了后续的正常检测和培养。

一种外周血ctc的检测方法，检测方法具体包括将上述捕获方法得到的带有磁性体的循环肿瘤细胞依次进行固定，染色和镜检。

在本发明应用较佳的实施例中，上述固定具体包括将带有磁性的循环肿瘤细胞涂布于粘附玻片上，干燥后，用固定液将带有磁性的循环肿瘤细胞固定。通过固定细胞，可以保持细胞表面抗原蛋白原有的结构和性质，也可以增强细胞在玻片上的粘附力，避免脱落。

在本发明应用较佳的实施例中，上述染色具体包括将荧光染料与标记有荧光标识物的第一抗体和第二抗体混合后，置于固定后的循环肿瘤细胞上，镜检观察，荧光染料为dapi，第一抗体为ck18抗体，ck8抗体，ck19抗体和panck抗体中的任意一种或多种的组合，第二抗体优选为cd45抗体；荧光标识物为cy3，cy5，fitc，pe和apc中的任意一种；

镜检第一抗体染色阳性，荧光染料染色阳性，第二抗体染色阴性，则判断该细胞为循环肿瘤细胞；若镜检第一抗体染色阴性，荧光染料染色阳性，第二抗体染色阳性，则判断该细胞为白细胞。

在本发明应用较佳的实施例中，上述第一抗体为ck18抗体，在其他实施例中，第二抗体也可以是其他白细胞受体。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种外周血ctc的捕获方法，该方法先将红细胞去除，减少了红细胞的干扰，然后采用第一亲和物与ctc优先结合的方案使抗体更容易与ctc结合，再利用第一亲和物和第二亲和物超强的亲和能力将磁性物质吸附在ctc上，从而使ctc带有磁性，在磁场的作用下从不带磁性的细胞中分离出ctc。通过多种抗体同时孵育，可以避免ctc异质性引起的漏捕；采用磁性分离，有效减少了对ctc的机械伤害。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例4中单独epcam抗体捕获mcf-7的镜检图；

图2为实施例4中单独her2抗体捕获mcf-7的镜检图；

图3为实施例4中epcam抗体和her2抗体联用捕获mcf-7的镜检图；

图4为物镜40倍下磁珠与捕获的mcf-7的效果图；

图5为物镜40倍下ck18染色效果图；

图6为物镜40倍下cd45染色效果图；

图7为物镜40倍下dapi染色效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种捕获外周血ctc的方法，具体包括如下操作步骤：

(1)将1倍体积的新鲜全血加入15ml离心管中，再加入3倍体积的红细胞裂解液。

(2)在冰上放置15分钟，期间颠倒混匀两次，红细胞裂解后，溶液应保持清亮透明。

(3)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(4)向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，重悬白细胞。

(5)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。通过步骤(1)-(5)可以有效去除红细胞，减少红细胞对富集ctc的干扰。

(6)使用0.5ml的2％bsa缓冲液重悬白细胞，加入生物素epcam抗体，旋转混匀仪低速孵育10～60min。

(7)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(8)使用1.5ml的0.5％bsa缓冲液重悬白细胞，加入亲和素磁珠，旋转混匀仪低速孵育60min。通过生物素和亲和素亲和作用，将磁珠结合到肿瘤细胞上，从而使肿瘤细胞带上磁性。

(9)将步骤(8)的离心管置于磁性分离器上，静置5min，用移液器吸去上清液。通过磁性分离可以将白细胞去除。

(10)从磁性分离器上取下离心管，加入1ml缓冲液，轻轻摇晃重悬磁珠，再次磁性分离，移去上清液。

(11)重复“步骤(9)”两次，共洗涤三次。通过步骤(9-11)将白细胞去除。

在其他实施例中，也可以采用白细胞抗体结合白细胞，从而去除白细胞。

实施例2

本实施例提供了一种捕获外周血ctc的方法，具体包括如下操作步骤：

(1)将1倍体积的新鲜全血加入15ml离心管中，再加入3倍体积的红细胞裂解液。

(2)在冰上放置15分钟，期间颠倒混匀两次，红细胞裂解后，溶液应保持清亮透明。

(3)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(4)向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，重悬白细胞。

(5)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。通过步骤(1)-(5)可以有效去除红细胞，减少红细胞对富集ctc的干扰。

(6)使用0.5ml的2％bsa缓冲液重悬白细胞，加入生物素her2抗体，旋转混匀仪低速孵育10～60min。

(7)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(8)使用1.5ml的0.5％bsa缓冲液重悬白细胞，加入亲和素磁珠，旋转混匀仪低速孵育60min。通过生物素和亲和素亲和作用，将磁珠结合到肿瘤细胞上，从而使肿瘤细胞带上磁性。

(9)将步骤(8)的离心管置于磁性分离器上，静置5min，用移液器吸去上清液。通过磁性分离可以将白细胞去除。

(10)从磁性分离器上取下离心管，加入1ml缓冲液，轻轻摇晃重悬磁珠，再次磁性分离，移去上清液。

(11)重复“步骤(9)”两次，共洗涤三次。通过步骤(9-11)将白细胞去除。

实施例3

本实施例提供了一种捕获外周血ctc的方法，具体包括如下操作步骤：

(1)将1倍体积的新鲜全血加入15ml离心管中，再加入3倍体积的红细胞裂解液。

(2)在冰上放置15分钟，期间颠倒混匀两次，红细胞裂解后，溶液应保持清亮透明。

(3)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(4)向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，重悬白细胞。

(5)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。通过步骤(1)-(5)可以有效去除红细胞，减少红细胞对富集ctc的干扰。

(6)使用0.5ml的2％bsa缓冲液重悬白细胞，加入生物素epcam抗体和生物素her2抗体，旋转混匀仪低速孵育10～60min。

(7)在4℃下，450g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(8)使用1.5ml的0.5％bsa缓冲液重悬白细胞，加入亲和素磁珠，旋转混匀仪低速孵育60min。通过生物素和亲和素亲和作用，将磁珠结合到肿瘤细胞上，从而使肿瘤细胞带上磁性。

(9)将步骤(8)的离心管置于磁性分离器上，静置5min，用移液器吸去上清液。通过磁性分离可以将白细胞去除。

(10)从磁性分离器上取下离心管，加入1ml缓冲液，轻轻摇晃重悬磁珠，再次磁性分离，移去上清液。

(11)重复“步骤(9)”两次，共洗涤三次。通过步骤(9-11)将白细胞去除。

实施例4

用5000个mcf-7乳腺癌-肿瘤细胞分别替换实施例1,2和3中的样本新鲜全血依次进行捕获试验，其余捕获步骤分别按照实施例1,2和3中的方法进行，将捕获得到的磁珠分别加入50ulpbs缓冲液进行重悬，再将50ul磁珠分别均匀涂布于粘附玻片上，放入干燥箱中，45℃烘干5min。取出粘附玻片，分别在粘附玻片上滴加400ul固定液，使将涂布的磁珠全部被固定液覆盖，室温静置10min。弃去固定液，将粘附玻片插入清水中清洗。取200uldapi与5ulck18抗体染液和5ulcd45抗体染液混合，再滴加至粘附玻片上，室温静置10min。静置后，清洗粘附玻片上的染液，镜检观察。若镜检ck18染色阳性，dapi染色阳性，cd45染色阴性，则判断该细胞为循环肿瘤细胞；若镜检ck18染色阴性，dapi染色阳性，cd45染色阳性，则判断该细胞为白细胞。

经检验，参照图1所示，实施例1中的单独epcam抗体捕获mcf-7效率为55.2％；参照图2所示，实施例2中的单独her2抗体捕获mcf-7效率为40.95％；参照图3所示，实施例3中epcam抗体和her2抗体联用捕获mcf-7效率为72.66％。

本实施例中同一视野下物镜40倍下的镜检染色图参照图4-图7所示。本实施例中ck18染液选择的抗体染液为effuor570。图4为物镜40倍下磁珠与捕获的mcf-7的效果图，其中大的细胞即为mcf-7，周边小颗粒为磁珠。图5为ck18染色效果图，由图可知ck18染色呈阳性。图6为cd45染色效果图，由图可知cd45染色呈阴性。图7为dapi的染色效果图，由图可知，dapi染色呈阳性。由此，判断图4中捕获的细胞为mcf-7。

实施例5

本实施例中将mcf-7乳腺癌-肿瘤细胞分别与epcam抗体，her2抗体以及epcam抗体和her2抗体混合物孵育，用pbs洗涤出去多余抗体，用pbs缓冲液重悬细胞，细胞计数后，取少量肿瘤细胞稀释成每500ul包含50～60个肿瘤细胞，加入磁珠捕获，磁性回收，pbs清洗3次，镜检检验捕获效果。

结果显示，单独epcam抗体捕获率为95.9％，单独her2抗体捕获率为92.1％，epcam抗体和her2抗体联用捕获率为100％。本实施例比实施例4中的捕获率高的原因在于，实施例4中加入了过量的mcf-7肿瘤细胞，抗体已过饱和的结合了mcf-7，无法再结合更多的肿瘤细胞，因此，实施例4的捕获率要低于本实施例的捕获率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。