活化部分凝血活酶时间测定用试剂及试剂盒、测定方法、及抑制鞣花酸化合物沉淀的方法与流程

本发明涉及活化部分凝血活酶时间测定用试剂及试剂盒。另外，本发明涉及活化部分凝血活酶时间的测定方法、抑制鞣花酸化合物的沉淀的方法。

背景技术：

鞣花酸具有活化接触因子系统的作用，因此鞣花酸经常作为凝固的活化剂用于活化部分凝血活酶时间(aptt)测定用试剂。但是，鞣花酸在如aptt测定用试剂所使用的水性溶剂中容易发生沉淀。一旦产生鞣花酸的沉淀，则凝固反应所必需的鞣花酸不足，不能准确地测定凝固时间。以往，作为抑制鞣花酸的沉淀的物质，将苯酚添加到包含鞣花酸的aptt测定用试剂中。但是，苯酚为加重环境负担的物质，对苯酚的使用限制日趋严格。因此，期望实质上不含苯酚、且鞣花酸的沉淀得到抑制的aptt测定用试剂。例如，专利文献1中记载了：作为抑制鞣花酸的沉淀的物质，将具有芳香环的氨基酸添加到aptt测定用试剂中。专利文献2中记载了：作为抑制鞣花酸的沉淀的物质，将聚乙烯醇化合物添加到aptt测定用试剂中。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2013-205087号公报

专利文献2：美国专利申请公开第2017/0059594号说明书

技术实现要素：

发明要解决的课题

本发明的目的在于，寻找环境负荷低、且可以抑制鞣花酸的沉淀的其它物质，提供鞣花酸的沉淀得到抑制的aptt测定用试剂及试剂盒。另外，本发明的目的在于提供使用这类物质测定aptt时间的方法、抑制鞣花酸的沉淀的方法。

用于解决课题的方案

本发明人发现，利用下述的式(i)所示的化合物可抑制鞣花酸化合物的沉淀，从而完成了本发明。由此，本发明提供一种活化部分凝血活酶时间测定用试剂，其包含鞣花酸化合物和下述式(i)所示的化合物。

【化1】

(式中，x为氢原子、-(c＝o)-y、或-(c＝o)-oz，y为羟基、氢原子、碳数1以上且6以下的直链状或支链状的烷基、或苯基，z为碱金属)

另外，本发明提供一种活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒，其包含：含有鞣花酸化合物和上述式(i)所示的化合物的第1试剂、以及包含钙盐的第2试剂。另外，本发明提供一种活化部分凝血活酶时间的测定方法，其包括：将血液被检体、含有鞣花酸化合物及上述式(i)所示的化合物的第1试剂、以及包含钙盐的第2试剂混合的工序；和测定所述工序中产生的混合物的活化部分凝血活酶时间的工序。进一步地，本发明提供一种抑制鞣花酸化合物沉淀的方法，其通过使鞣花酸化合物和上述式(i)所示的化合物在水溶液中共存，从而抑制鞣花酸化合物的沉淀。

发明效果

根据本发明，可以提供不包含作为加重环境负担物质的苯酚就使鞣花酸的沉淀得到抑制的aptt测定用试剂及试剂盒。

附图说明

图1为示出本实施方式的aptt试剂的一例的示意图。

图2为示出本实施方式的aptt试剂盒的一例的示意图。

图3为示出包含各种添加剂的鞣花酸金属离子络合物溶液的、络合物的粒径与氯化钠浓度的关系的坐标图。

图4a为示出以各种浓度包含没食子酸的鞣花酸金属离子络合物溶液的、络合物的粒径与氯化钠浓度的关系的坐标图。

图4b为示出以各种浓度包含连苯三酚的鞣花酸金属离子络合物溶液的、络合物的粒径与氯化钠浓度的关系的坐标图。

图5为示出使用包含没食子酸或连苯三酚的aptt试剂的、通过光学测定取得的凝固波形。

具体实施方式

[1.活化部分凝血活酶时间测定用试剂]

本实施方式的aptt试剂包含下述式(i)所示的化合物作为抑制鞣花酸沉淀的物质。

【化2】

(式中，x为氢原子、-(c＝o)-y、或-(c＝o)-oz，y为羟基、氢原子、碳数1以上且6以下的直链状或支链状的烷基、或苯基，z为碱金属)

式(i)中，作为碳数1以上且6以下的直链状或支链状的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、异戊基(isoamyl)、异己基等基团。式(i)中x为-(c＝o)-oz时，式(i)表示没食子酸的碱金属盐。作为碱金属，可列举例如钠、钾、锂等。这些中，优选钠及钾。

作为上述式(i)所示的化合物，可列举例如连苯三酚、没食子酸、3,4,5-三羟基苯甲醛、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯、没食子酸戊酯、没食子酸己酯、没食子酸异丙酯、没食子酸异丁酯、没食子酸异戊酯(isoamylgallate)、没食子酸异己酯、苯并连苯三酚(3,4,5-三羟基二苯甲酮)、没食子酸钠、没食子酸钾等。这些中，优选连苯三酚及没食子酸。

aptt试剂中的式(i)所示的化合物的含量可根据该试剂中的鞣花酸化合物的浓度来决定。aptt试剂中的鞣花酸化合物的浓度只要为aptt测定中通常使用的程度即可，aptt试剂中的式(i)所示的化合物的含量为例如0.001质量％以上且0.02质量％以下，优选为0.005质量％以上且0.02质量％以下。优选的实施方式中，aptt试剂中的式(i)所示的化合物的含量相对于鞣花酸化合物100质量份为5质量份以上且65质量份以下，更优选为20质量份以上且65质量份以下。

本实施方式的aptt试剂包含鞣花酸化合物作为活化剂。鞣花酸化合物可以为鞣花酸、鞣花酸盐、及鞣花酸的金属络合物中的任一种。金属络合物的中心金属可以为离子，也可以为原子。在鞣花酸的金属络合物之间，中心金属可以相同也可以不同。从活化作用的强度的观点出发，作为鞣花酸化合物，特别优选鞣花酸的金属离子络合物。作为金属离子，可列举例如锌离子、铝离子、锰离子等。aptt试剂中的鞣花酸化合物的浓度通常为10μm以上且400μm以下，优选为30μm以上且150μm以下。

在本实施方式中，可以进一步包含鞣花酸化合物以外的活化剂。这类活化剂只要为活化内源凝固途径中的接触因子的物质即可，可列举例如二氧化硅、高岭土、硅藻土等。例如，在活化剂为二氧化硅的情况下，aptt试剂中的该活化剂的含量通常为0.1mg/ml以上且1.0mg/ml以下，优选为0.2mg/ml以上且0.6mg/ml以下。

本实施方式的aptt试剂优选包含磷脂。作为磷脂，可列举例如磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰丝氨酸(ps)等。本实施方式的aptt试剂优选包含选自由pe、pc及ps组成的组中的至少1种，更优选包含pe、pc及ps。磷脂可以为天然来源的磷脂，也可以为合成磷脂。作为天然来源的磷脂，可列举例如来自兔脑、牛脑、人胎盘、大豆、蛋黄等的磷脂。特别优选合成磷脂或纯化到纯度99％以上的天然来源的磷脂。

pe、pc及ps的脂肪酸侧链(酰基)没有特别限定，可列举例如碳数8以上且20以下、优选碳数14以上且18以下的酰基。作为这类酰基，可列举例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基等。pe、pc及ps均在分子内具有2个脂肪酸侧链。pe、pc及ps各分子中的2个脂肪酸侧链可以相同，也可以不同。

作为具体的pe，可列举例如二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺等。作为具体的pc，可列举例如二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱等。作为具体的ps，可列举例如二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸等。

aptt试剂中的磷脂的浓度可根据磷脂的种类及测定条件等适宜决定。例如，aptt试剂中的磷脂的浓度为30～2000μg/ml，优选为60～1000μg/ml。aptt试剂包含pe、pc及ps作为磷脂的情况下，在该试剂中，pe浓度通常为10～700μg/ml，优选为30～300μg/ml，pc浓度通常为20～1000μg/ml，优选为30～500μg/ml，ps浓度通常为3～300μg/ml，优选为5～150μg/ml。

本实施方式的aptt试剂优选包含金属离子。通过包含金属离子，可期待接触因子的活化作用、及抑制沉淀物的产生的效果。另外，试剂中的鞣花酸与由金属离子形成化合物所产生的金属离子形成鳌合物，成为鞣花酸的金属离子络合物。包含金属离子的aptt试剂可通过将金属离子形成化合物添加到aptt试剂中来制备。金属离子形成化合物为在水溶液中电离而产生金属离子的化合物。金属离子形成化合物只要在aptt试剂中产生金属离子、且由该化合物所产生的阴离子不抑制血液凝固反应就没有特别限定。作为金属离子形成化合物，可列举例如金属与有机酸或无机酸的盐。这些中，优选金属与无机酸的盐，可列举例如盐酸、硫酸、硝酸等酸与金属的盐。更优选的金属盐为选自锌盐、锰盐、铝盐及镍盐中的至少1种金属的盐。金属离子形成化合物可以为1种，也可以将两种以上组合。优选的实施方式中，金属离子形成化合物为锌离子形成化合物与铝离子形成化合物的混合物、或锰离子形成化合物与铝离子形成化合物的混合物。作为这类化合物，可列举例如氯化锌、氯化锰、氯化铝、氯化镍等。金属离子形成化合物可以为无水物，也可以为水合物。aptt试剂中的金属离子的浓度为例如1μm以上且1mm以下，优选为10μm以上且500μm以下。

为了提高稳定性，本实施方式的aptt试剂可以进一步包含非极性氨基酸。作为非极性氨基酸，可列举例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸等。甘氨酸也作为缓冲剂起作用，苯丙氨酸也作为鞣花酸的沉淀防止剂起作用，因此，作为非极性氨基酸，优选甘氨酸及苯丙氨酸。非极性氨基酸可以为l体、d体及它们的混合物中的任一种。非极性氨基酸可以为天然来源的氨基酸，也可以为合成氨基酸。aptt试剂中的非极性氨基酸的浓度可以适宜设定，通常为0.75质量％以上，优选为0.75质量％以上且5质量％以下，更优选为0.75质量％以上且1.5质量％以下。

本实施方式的aptt试剂可以进一步包含用于提高保存性及稳定性的添加物。作为这类添加物，可列举例如防腐剂、抗氧化剂、稳定化剂等。作为防腐剂，可列举例如氨基糖苷系抗生素等抗生素、叠氮化钠等。可以添加proclin(商标)300等市售的防腐剂。作为抗氧化剂，可列举例如丁基羟基茴香醚等。作为稳定化剂，可列举例如聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等。

本实施方式的aptt试剂中使用的溶剂可以从血液检查领域通常使用的水性溶剂中适宜选择。作为这类水性溶剂，可列举例如水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液的ph优选为6以上且8以下，更优选为7以上且7.6以下。作为缓冲液，可列举例如hepes、taps、mops、bes、tes等good’s缓冲液、tris盐酸缓冲液(tris-hcl)、owren’sveronal缓冲液、咪唑盐酸缓冲液等。缓冲液中所含的缓冲剂可以为1种，也可以为两种以上。根据需要，可以向缓冲液中添加甘氨酸。

本实施方式的aptt试剂的ph通常为6以上且8以下，优选为7以上且7.6以下。aptt试剂的ph可通过添加上述缓冲液来调整。

本实施方式的aptt试剂通过包含上述式(i)所示的化合物，不仅可以防止鞣花酸的沉淀，而且还可以降低aptt的光学测定中的初期反应异常。初期反应异常是指：从向血液被检体中添加aptt试剂即刻起，被检体的光学测定值发生变化的现象。在将正常的血液被检体与aptt试剂混合时，通常添加试剂起至纤维蛋白析出(开始凝固)期间，被检体的光学测定值几乎不变，从纤维蛋白析出起大幅变化。但是，凝固异常的患者的血液被检体中，有时会产生初期反应异常。根据测定装置，而存在在检测到初期反应异常时不能取得正确的凝固时间的情况。

本实施方式的aptt试剂除了使用上述式(i)所示的化合物代替苯酚来作为鞣花酸的沉淀防止剂以外，可以与以往的aptt试剂的制造方法同样地制造。作为一例，对包含磷脂的本实施方式的aptt试剂的制备进行说明。首先，将鞣花酸或鞣花酸盐溶解于水性溶剂而制备鞣花酸的水性溶液。作为水性溶剂，优选good’s缓冲液。向得到的鞣花酸容液中添加金属离子形成化合物，从而制备包含鞣花酸的金属离子络合物的溶液。向得到的溶液中添加上述磷脂，从而可以得到包含磷脂的本实施方式的aptt试剂。根据需要，可以添加上述的非极性氨基酸、防腐剂、抗氧化剂、稳定化剂等。

本实施方式的aptt试剂可以与以往的aptt试剂同样地在常规的aptt测定条件下使用。另外，本实施方式的aptt试剂与以往的aptt试剂同样地可以用于内源凝固因子的筛选检查、肝素疗法的监测、狼疮抗凝物(la)的筛选检查。本实施方式的aptt试剂与血液被检体的混合比以体积比表示可以为8：2～2：8左右，优选为5：5。换言之，本实施方式的aptt试剂的添加量可以为血液被检体的量(体积)的0.25倍以上且4倍以下的量(体积)。优选本实施方式的aptt试剂的添加量与血液被检体的量(体积)为等量。

在使用本实施方式的aptt试剂测定正常被检体的凝固时间时，可以得到与以往的aptt试剂同等程度的测定结果。例如，将本实施方式的aptt试剂与含钙离子的水溶液一起适宜地使用并测定规定的正常血浆(例如希森美康株式会社制的コアグトロールix)的aptt时，期望aptt为30秒左右(例如25秒以上且35秒以下)。另外，测定规定的异常血浆(例如希森美康株式会社制的コアグトロールiix)的aptt时，期望aptt达到60～100秒的范围内。

在本实施方式中，可以将收容有aptt试剂的容器包装成箱而提供给用户。箱中可以一同装入记载有aptt试剂的使用方法等的附加文件。图1示出本实施方式的aptt试剂的例子。参照图1，10表示收容有本实施方式的aptt试剂的容器，11表示包装箱，12表示附加文件。

[2.活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒]

本实施方式的aptt测定用试剂盒(以下也称为“试剂盒”)包含：含有鞣花酸化合物和上述式(i)所示的化合物的第1试剂、以及包含钙盐的第2试剂。作为第1试剂，可以使用上述本实施方式的aptt试剂。第1试剂的详细情况与关于本实施方式的aptt试剂而说明的情况相同。鞣花酸化合物的详细情况如上所述。

第2试剂为添加于血液被检体与第1试剂的混合物、引发血液凝固的试剂。第2试剂优选为含钙离子的水溶液。作为含钙离子的水溶液，优选钙盐的水溶液。作为钙盐，可列举例如氯化钙等。第2试剂中的钙离子浓度通常为2.5mm以上且40mm以下，优选为10mm以上且30mm以下。在使用氯化钙等容易溶解于水的钙盐时，第2试剂中的钙离子浓度可以以该钙盐的浓度来表达。

在本实施方式中，可以将收容第1试剂的容器及收容第2试剂的容器包装成箱而提供给用户。箱中可以一同装入记载有aptt试剂盒的使用方法等的附加文件。图2示出本实施方式的aptt试剂盒的例子。参照图2，20表示本实施方式的试剂盒，21表示收容有第1试剂的第1容器，22表示收容有第2试剂的第2容器，23表示包装箱，24表示附加文件。

本实施方式的试剂盒中，作为其它试剂，可以进一步包含通常用于aptt测定的试剂等。作为这类试剂，可列举例如参照用血浆、稀释用水性介质等。作为参照用血浆，可列举例如正常血浆、精度管理用血浆、缺乏各种凝固因子的血浆、含la的血浆、含肝素的血浆等。稀释用水性介质为用于稀释第1试剂的水性介质。例如，在使用具备包含磷脂的第1试剂的本实施方式的试剂盒检测la时，用稀释用水性介质将第1试剂稀释，降低第1试剂的磷脂浓度。由此，更容易表现la所致的磷脂抑制反应。在血液检查领域，将由稀释的第1试剂及第2试剂测定的aptt称为“稀释aptt”(daptt)。

[3.抑制鞣花酸化合物的沉淀的方法]

另一实施方式提供一种抑制鞣花酸化合物沉淀的方法。该方法中，通过使鞣花酸化合物和上述式(i)所示的化合物在水溶液中共存来抑制鞣花酸化合物的沉淀。鞣花酸化合物及式(i)所示的化合物的详细情况如上所述。水溶液只要为能够溶解鞣花酸化合物及式(i)所示的化合物的水性溶剂即可。这类水性溶剂的详细情况与关于本实施方式的aptt试剂中使用的水性溶剂而说明的详细情况相同。

使鞣花酸化合物与上述式(i)所示的化合物在水溶液中共存的方法没有特别限定。例如，可以向包含式(i)所示的化合物的水溶液中添加鞣花酸化合物。另外，可以向包含鞣花酸化合物的水溶液添加式(i)所示的化合物。或者，可以将包含式(i)所示的化合物的水溶液与包含鞣花酸化合物的水溶液混合。

如后述的实施例所示，对于不含式(i)所示的化合物的鞣花酸化合物水溶液而言，若增加该水溶液中的盐浓度则由于盐析效应而产生鞣花酸化合物的沉淀。但是，在使鞣花酸化合物与上述式(i)所示的化合物在水溶液中共存时，即使增加水溶液中的盐浓度，鞣花酸化合物的沉淀也得到抑制。

[4.活化部分凝血活酶时间的测定方法]

本实施方式的aptt的测定方法(以下也称为“测定方法”)包括下述步骤：将血液被检体、包含鞣花酸化合物及上述式(i)所示的化合物的第1试剂、以及包含钙离子的第2试剂混合，测定凝固时间。作为第1试剂，可以使用上述本实施方式的aptt试剂。或者，作为第1试剂及第2试剂，可以使用上述本实施方式的试剂盒。

作为血液被检体，使用从被检者采集的血液或由该血液制备的血浆。优选的血液被检体为血浆。血液被检体中可以添加有血液检查通常所用的公知的抗凝固剂。作为这类抗凝固剂，可列举例如柠檬酸三钠。通过本实施方式的测定方法进行肝素疗法的监测时，使用已给药肝素的被检者的血液或血浆。在添加第1试剂之前，可以在例如35℃以上且40℃以下的温度下将血液被检体孵育30秒以上且2分钟以下的时间。

在本实施方式中，首先将血液被检体与第1试剂混合。第1试剂与血液被检体的混合比以体积比表示可以为8：2～2：8左右，优选为5：5。换言之，第1试剂的添加量可以为血液被检体的量(体积)的0.25倍以上且4倍以下的量(体积)。优选第1试剂的添加量与血液被检体的量(体积)为等量。将血液被检体与第1试剂混合后，优选将混合物在规定条件下孵育。作为规定条件，可列举例如以下条件：在35℃以上且40℃以下的温度下孵育2分钟以上且5分钟以下的时间。

接着，将血液被检体与第1试剂的混合物和第2试剂混合。以下也将血液被检体、第1试剂及第2试剂的混合物称为“测定试样”。关于第2试剂的添加量，只要使测定试样中的钙离子浓度达到通常2mm以上且20mm以下、优选4mm以上且10mm以下的量(体积)即可。关于测定试样的制备，可以通过手工方法进行，也可以通过全自动测定装置进行。作为这类装置，可列举例如全自动血液凝固测定装置的cs系列(希森美康株式会社)等。

在本实施方式中，将添加第2试剂的时刻作为测定开始点，并测定凝固时间。关于凝固时间，可以通过手工方法测定，也可以通过全自动测定装置测定。手工方法中，使用秒表等通过目视测定直至纤维蛋白析出的时间。在使用全自动测定装置时，关于凝固时间，可以通过光学测定法来测定，也可以通过物理测定法来测定。光学测定法中，例如对测定试样照射光，取得与透射度、吸光度、散射光强度等有关的光学信息，基于取得的信息取得凝固时间。物理测定法中，例如使用钢球取得与测定试样的粘度等有关的物理信息，基于取得的信息来取得凝固时间。全自动测定装置没有特别限定。例如，全自动血液凝固测定装置的cs系列(希森美康株式会社)可以测定基于透射度、吸光度、散射光强度等光学信息的凝固时间。全自动血液凝固纤溶测定装置stacompact(ロシュ·ダイアグノスティックス株式会社)可以测定基于粘度等物理信息的凝固时间。

以下通过实施例详细地说明本发明，本发明不受这些实施例限定。

【实施例】

实施例1：鞣花酸化合物的沉淀的抑制效果的研究

在包含鞣花酸的金属离子络合物作为活化剂的aptt试剂中，盐浓度增加时，络合物粒径由于盐析效应而增加，最终产生沉淀。利用该盐析原理，确认各种添加剂在鞣花酸金属离子络合物溶液中的沉淀抑制效果。

(1)鞣花酸金属离子络合物溶液的制备

制备包含作为缓冲液成分的50mmhepes、8mmtaps及1质量％甘氨酸、以鞣花酸的金属离子络合物计为100μm的鞣花酸、60μm氯化锌及50μm氯化铝、作为防腐剂的0.05％proclin(商标)300(sigma-aldrich公司)的鞣花酸金属离子络合物溶液。将该溶液与作为添加剂的选自没食子酸、连苯三酚、对苯二酚、5-甲基连苯三酚、间苯二酚、及环己三醇中的至少1种混合，得到以100μm的浓度包含各添加剂的络合物溶液。作为对照，使用不含添加剂的鞣花酸金属离子络合物溶液。

(2)沉淀抑制效果的研究

将上述(1)中制备的各络合物溶液和5m氯化钠溶液混合，得到氯化钠浓度为10mm、50mm或100mm的混合液(试验区)。通过使用zetasizernano(malvern公司)的动态散射光法确认各混合液的盐浓度与络合物的平均粒径的关系性。将结果示于图3。如图3所示，可知：在添加没食子酸或连苯三酚的试验区，粒径的增加相对于盐浓度的增加的程度小。实际上，在氯化钠浓度为100mm时，虽然在添加了没食子酸或连苯三酚的试验区目视未能确认到沉淀，但是在包含其它添加物的试验区及无添加剂的试验区目视确认到沉淀。

(3)添加剂浓度与沉淀抑制效果的关系性的研究

将可见抑制络合物粒子的沉淀的效果的没食子酸及连苯三酚以达到图4a及4b所示的浓度的方式添加到鞣花酸金属离子络合物溶液中。使用以各种浓度包含没食子酸或连苯三酚的络合物溶液，与上述(2)同样地确认沉淀抑制效果。将结果示于图4a及b。显示：在任一浓度下均可见沉淀抑制效果。

实施例2：凝固的初期反应异常的抑制效果的研究

通过使用包含连苯三酚或没食子酸的aptt试剂来研究是否可抑制初期反应异常。

(1)aptt试剂的制备

制备包含作为缓冲液成分的50mmhepes、8mmtaps及1质量％甘氨酸、以鞣花酸的金属离子络合物计为100μm的鞣花酸、60μm氯化锌及50μm氯化铝、作为防腐剂的0.05％proclin(商标)300(sigma-aldrich公司)的鞣花酸金属离子络合物溶液。将络合物溶液与作为添加剂的没食子酸或连苯三酚混合，得到以100μm的浓度包含没食子酸或连苯三酚的络合物溶液。作为对照，使用不含添加剂的鞣花酸金属离子络合物溶液。作为磷脂成分，将pe(l-α-磷脂酰乙醇胺)、pc(l-α-磷脂酰胆碱)及ps(l-α-磷脂酰丝氨酸)以各自的终浓度达到10mg/dl、45mg/dl及5mg/dl的方式添加到各络合物溶液中，制备aptt试剂。各aptt试剂中的没食子酸及连苯三酚的含量分别为0.013质量％及0.009质量％。另外，各aptt试剂中，每100质量份鞣花酸中的没食子酸及连苯三酚的含量分别为43质量份及32质量份。

(2)初期反应异常的抑制效果的研究

向冷冻血浆中添加超低密度脂蛋白(vldl)及c反应蛋白(crp)，使其分别达到100μg/ml及300μg/ml的终浓度，制备诱发凝固的初期反应异常的模拟试样。对于该模拟试样，利用设置有上述(1)所制备的试剂及含钙离子的试剂的全自动凝固测定装置cs-5100(希森美康株式会社)进行aptt测定，取得其凝固波形。图5示出使用各aptt试剂的测定所得到的凝固波形。

如图5所示，对照区(不含添加剂的aptt试剂)中，添加试剂起即刻的光学测定值急剧降低，观察到凝固的初期反应异常。另一方面，使用包含没食子酸或连苯三酚的aptt试剂的试验区中，添加试剂后的光学测定值的降低变得平缓，可以确认凝固的初期反应异常被降低。

符号说明

10：收容本实施方式的aptt试剂的容器

20：本实施方式的试剂盒

21：第1容器

22：第2容器

11、23：包装箱

12、24：附加文件