磁力弛豫检测分析物的方法和化合物以及它们的用途的制作方法

专利名称：磁力弛豫检测分析物的方法和化合物以及它们的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及权利要求书中所示特征的主题，即定性和/或定量磁力弛豫检测液相和固相中之分析物的方法，磁力弛豫检测所用的化合物，以及它们在分析和免疫磁力记录法中的用途。
已知免疫闪烁记录法借助于放射性标记的结构特异性物质(下文也称为标记物)使得检测体内病理学组织成为可能。为此通常使用经υ-射线标记的抗体或抗体片段。另外，其他结构特异性物质，例如肽或寡核酸或多聚核酸也可以被使用或正在被研究。然而，在所有这些方法中特异性结合的放射性部分普遍都小，因而在这些研究中，未特异性结合并因此在血液中循环或在如肝脏、肾脏、外输尿道或膀胱的器官中积累的标记物水平很高。在多种情况下，这种高水平的背景放射物妨碍了对病理学组织的充分检测。因此潘查帕凯尚[免疫细胞生物学，70-(1992)295]和齐格勒[英格兰药物通讯，324(1991)430]求助于改进免疫闪烁记录法的方法，这种方法也描述于EP0251494中。大多数方法的目的在于加速非特异性结合的放射性的消除。
此外，在多种场合下已建议使用与顺磁或超顺磁物质偶联的抗体或抗体片段以定位体内病理学组织。迄今，核自旋断层X线照相术或基于磁化率之变化的磁力测量学(WO93/05818和WO91/15243)已被当作此类经标记抗体的检测方法。在这些检测方法中，依然存在的困难是由于标记物的未结合部分以及组织磁化率和弛豫能力之自然变化而引起的信号可变部分。另外，此类方法经常不能敏感到足以能检测只是少量的特异性结合标记物。
然而，仅能够检测到结合标记物部分因此不会受未结合标记物程度影响的方法仍是未知的。
还已知定量的免疫测定法以及其他结合测定法(如受体结合测定法)可以测定不断变换组合的样品中大量有生物学关联的物质。然而，用这种方法在每次测定中通常仅能测定每份样品的一个参数。现存的多种方法的概况见T.查德[放射免疫测定及相关技术介绍生物化学和分子生物学中的实验室技术，第四卷，埃尔塞韦尔科学出版社，阿姆斯特丹(1990)]。所有结合测定的基础是经同位素或其他一些具有高的配体-受体反应高特异性的方法标记的化合物的高的检测敏感性。
但是，已知的测定方法具有下列缺陷·同时检测同一样品中多种分析物的方法基于多种放射性、荧光或酶学标记的探针与分析物的结合。在这种情况下，则通常要在随后的分离与洗涤之后可测得定量检测分析物之探针的未结合或结合活性。这样的话，可以使用的不同探针标记物的量很受限制。因此，例如在不同的放射性同位素作为探针标记物的情况下，会发生所谓的重叠现象，它可导致个别信号定量准确度的迅速下降。联合多种酶作为探针标记物会导致类似的问题，为此，必须研究能允许同时检测一个系统中的酶反应的反应条件，这进一步阻碍了这种方法的可行性。
·此方法的敏感性受，例如基质和探针之间非特异性相互作用的限制，或者也受探针有限的标记能力(低特异活性)的限制。
·此方法的成功实施经常需要处理所得的样品材料(例如从全血中生产血清或血浆，用有机溶剂提取样品、使用色谱方法浓缩分析物等)。
·为了成功实施此方法，大多数情况下，在分离结合和未结合受体或配体中使用的分离和洗涤步骤是必需的。
·为了进行放射性免疫测定法，必须使用昂贵且不易操作的辐射核素。
·在实践中，先被使用的标记物的贮存经常导致困难，因为它们既不稳定(放射性免疫测定法)，因此必须即时新鲜制备，否则它们以敏感的方式与环境中的影响物反应。
因此，本发明的目的是开发新的方法和物质，它们能克服现有技术的缺陷，特别是能够不使用放射性物质检测到保留位点，不经预先分离未结合标记物而检测到结合标记物的水平。
通过本发明可达到此目的。
已发现如果在免疫测定法或其他结合测定法中将铁磁性或亚铁磁性胶粒用作欲被鉴定的磁性标记，而它们的磁化强度弛豫被作为测量变量测定，那么定性和/或定量检测液相和/或固相中的分析物则是可能的。
下文首次描述了克服了已知的实施免疫测定或其他结合测定之方法的缺陷的方法。
本发明的方法基于铁磁性或亚铁磁性胶体物质(下文也称作磁性标记)的使用，该物质与欲被鉴定的物质(下文也称作分析物)或结构特异性物质结合。根据本发明的磁性标记与分析物或结构特异物质的这种结合(在本专利中将更详细地描述)在下文中也称作磁性标记物。通过术语胶体物质或胶体颗粒的使用，描述了所述颗粒或物质的大小范围均在胶体的大小范围之内，即从1nm直至约1000nm的范围，还描述了它们在适当分散介质中作为分散相的用途(大多数情况下为含水的)。为了确保贮存和运输能力的改善，可以干燥或冷冻的形式提供胶体物质或颗粒；然而当进行测量时，它们以分散状态下的液相被提供。
另外，此方法基于特殊的测量技术，它使得磁性标记或磁性标记物被磁化后，测定磁化强度的弛豫成为可能，本发明的这种测量方法(在本专利中将更详细地描述)在下文中也称为磁力弛豫检测法。
本发明的主要原理是当外磁场关闭后，可自由移动的铁磁性或亚铁磁性胶粒的磁化强度在测量时间内通过两种不同的机理弛豫i)整个胶粒在周围液体中的旋转，藉此，时间常数取决于包括外壳的颗粒的流体动力学直径、载液的粘性和温度，它主要反映颗粒附近地方的参数；此机理在下文中也称作Brownian弛豫或非本征超顺磁学，和ii)胶体颗粒内的内部磁化载体的旋转，藉此，时间常数以很敏感的方式取决于所用颗粒的材料和形状(所用颗粒材料的各向异性常数)、体积和温度。这些是颗粒的基本内在的参数；此机理在下文中也称作Neelian弛豫或本征超顺磁学。
本发明的目的可凭借以下事实达到，即在免疫测定法或其他结合测定法中，将铁磁性或亚铁磁性胶粒用作欲被鉴定的磁性标记，所用的胶粒在测量条件下以未结合的状态，它们的Brownian弛豫进行得比Neelian弛豫快。由于因结合而导致的占优势的弛豫机理的变化或颗粒体积成比率地增大，使得使用这种铁磁性或亚铁磁性胶粒除了测定同时存在于测量样品中的未结合磁性标记物外，还能特异性测定结合磁性标记物部分成为可能。
通过使用敏感的测量方法，使用铁磁性或亚铁磁性胶粒可在本发明程序中建立超高敏感的既可在液相中进行也可在固相中进行的结合特异性免疫测定法或其他结合测定法。作为一种特别敏感的测量方法，当样品在磁场中被磁化且磁场被关闭之后，借助于高度敏感的磁场检测器(如超导量子干涉装置(SQUID)、电感线圈、饱和式磁力仪、大磁阻传感器、或磁阻转换器)可检测磁化强度的弛豫，或者样品的复合磁化率可作为磁场频率的函数被测定。
此外，在本发明的磁力弛豫定量检测液相和固相中分析物的方法中，先与分析物结合的结构特异性物质被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记。
这些磁性标记的结构特异性物质被用于欲被测定的液体或固定化的样品，借助于外部提供的磁场，欲被测定的样品被磁化。当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器可测量磁性标记物磁化强度的弛豫。
根据本领域技术人员已知的方法，在此处评价了测量结果，在下文描述的直接测定方法中也有此评价。
根据本发明的磁力弛豫定量检测液相和固相中分析物的方法也可按下列方式进行，分析物首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，然后ii)将这些经磁性标记的分析物用于欲被测定的液体或固定化的样品中，加入与分析物特异性结合的物质，借助于外部提供的磁场，使欲被测定的样品磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器可测量磁性标记物磁化强度的弛豫。
根据本领域技术人员已知的方法，即与免疫测定法或放射性测定法中所用的相类似的方法，在此处评价了测量结果，在下文描述的竞争性测定法中也有此评价。
在上述两种情况下，磁性标记或磁性标记物因结合而改变的复合磁化率的测定也可用作频率函数以供分析。
结合和未结合的标记物可以通过使用它们不同的弛豫机理或因结合引起的磁性标记物弛豫时间的影响而被区分开，这种区分以前仅在特殊场合下才能进行。
根据本发明，特别是通过与分析物结合的结构特异性物质可鉴定固-相-结合的分析物，结构特异性物质首先
i)被在测量时间范围内弛豫的铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，其中铁磁性或亚铁磁性胶粒的选择原则是，其在测量条件下的Browrvian弛豫的弛豫时间比Neeleian弛豫的驰豫时间短，然后ii)这些经磁性标记的物质被用于欲被测定的固定化样品，借助于外部提供的适当强度的磁场，欲被测定的样品被磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器可测出磁性标记物磁化强度的弛豫，藉此将固相结合和未结合的磁性标记物的不同弛豫行为用作分析。作为测量变量，样品的复合磁化率也可作为频率的函数被测定。
在这种情况下，也可以用欲被鉴定的分析物替代结构特异性物质与磁性标记相结合。
在液相中，特别可以通过与分析物结合的结构特异性物质来检测本发明的分析物，结构特异性物质首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，其中铁磁性或亚铁磁性胶粒的选择原则是，其在测量条件下的在Brownian弛豫的弛豫时间比Neelian弛豫的弛豫时间短，然后ii)这些经磁性标记的物质被用于欲被测定的样品，借助于外部提供的适当强度的磁场，欲被测定的样品被磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器可测量磁性标记物磁化强度的弛豫，藉此与分析物结合的磁性标记物相对于未结合的磁性标记物的不同弛豫行为被用于分析。
作为测量变量，样品的复合磁化率也可作为频率的函数被测定。
在这种情况下，也可以用欲被测定的分析物替代结构特异性物质与磁性标记相结合。
结构特异物质被限定为所有与某种结构特异性结合的物质。结构特异性物质尤其可被限定为抗体、抗体片段、生物素、或与生物素结合的物质如亲和素和链霉亲和素、与受体特异性结合的激动剂，如细胞因子、淋巴因子、内皮肽或它们的拮抗物、特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、糖类、脂蛋白等。作为结构特异性物质优选那些结合常数范围为105-1015(mol/l)-1的物质，特别优选那些结合常数范围为107-1015(mol/l)-1的物质。
借助于在免疫化学、肽化学和蛋白质化学中熟悉的方法，可用铁磁性或亚铁磁性颗粒标记结构特异性物质或欲被鉴定的分析物。尤其有利的是结构特异性物质或欲被鉴定的分析物与形成铁磁性或亚铁磁性颗粒之稳定外壳的物质之间的共价健。特别适合的方法的例子是借助于碳二亚胺的激活和偶联[雅各比和威尔彻等人，酶学方法，(1974)34]，当高碘酸暴露于含糖类的化合物后形成希夫碱(维歇克和拜尔等人，酶学方法，184177)，然后它们被非强制性地还原以进一步稳定，借助于戊二醛偶合(海斯曼和理查德Natt.Acad.Sci.USA 71(1974)3537]、溴乙酰化颗粒与硫基化物质交联(阿吉尔等人，细胞学9(1976)81]、以及还原烷基化(拜尔等人.，J.Histechem.Cytochem.24(1976)933)。
也可将铁磁性或亚铁磁性胶粒制成具有由结构特异性物质或欲被鉴定的分析物制成的稳定外壳的形式，方法是将生产出的颗粒直接投入结构特异性物质的溶液中可选择性地存在其它佐剂，例如蛋白质、糖类以及天然、合成、或部分合成的表面活性物质等，或者也可以在结构特异性物质的存在下直接生产。
适当的胶粒和含有这些颗粒的悬浮液被描述于例如WO 92/12735、WO/92/22586、EP 0186616和US 4101435中。
根据本发明的方法可被用于例如能育性、组织相容性、变态反应学、传染病学、卫生学、遗传学、病毒学、细菌学、毒理学、病理学、环境分析和医学诊断。
本发明的另一个目的是磁力弛豫检测所用的化合物，它由可自由移动的铁磁性或亚铁磁性颗粒的胶体悬浮液与结构特异性物质或欲被鉴定的分析物组成，其中结构特异性物质被特别限定为抗体、抗体片段、生物素或与生物素结合的物质，如亲和素和链霉亲和素、与受体特异性结合的激动剂如细胞因子、淋巴因子、内皮肽或它们的拮抗剂，其他特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸，脱氧核糖核酸、糖类、脂蛋白等。
磁力弛豫检测所用的化合物也可由几种弛豫时间可以区分开的铁磁性或亚铁磁性颗粒联合组成，因为通过使用针对样品内不同的结构特异性物质或分析物而分别具有很狭窄的弛豫时间和/或磁矩分布的不同磁性标记，即可测出各自可区分开的测量结果。结果，使得直接同时定量检测几种分析物成为可能。
作为悬浮液的基质，所述的胶粒能在其中自由移动的所有液体都适合。特别适合的是水、表面活性佐剂的水溶液，例如表面活性剂或寡聚或多聚糖类和蛋白质，以及水和醇类例如甘油和聚乙二醇的混合物。悬浮液介质另外还可含有能改变渗透压的佐剂，例如粗盐。另外，也可含有决定pH的缓冲物质，例如磷酸盐。
由铁磁性或含亚铁磁性胶粒与结构特异性物质或欲被鉴定之分析物制成的化合物也可以干燥的形式被提供，可选择性地与其他例如可促进干燥或增加干品稳定性的佐剂结合(例如冻冷干燥剂)。
经过或不经过分离和洗涤的步骤即可找到分析物。在进行具有分离结合和未结合磁性标记物之步骤的测量时，根据本发明，所有铁磁性或亚铁磁性胶体物质都可用作磁力弛豫检测的磁性标记。在这些情况下，对Brownian弛豫时间和Neelian弛豫时间的特殊要求就不是必需的了。
由于基于物理机理的结合鉴定，非特异性测量信号(矩阵现象)可被大量消除。因此此方法的特异性仅取决于结构特异性物质“真实”的特异性(抗体的交叉反应性，配体的非特异性结合)。
由于本发明方法高度的敏感性，使其在结合测定法通常遇到的检测限度以下的条件下易于维持。
作为磁性标记物质，可以使用能在适于磁力弛豫检测的介质中被胶体状分散的所有铁磁性或亚铁磁性材料。当使用磁力弛豫检测物时，在测量条件下磁性标记的Neelian弛豫时间必须比磁性标记物的Brownian弛豫时间长，所述磁力弛豫检测无需进行结合和未结合磁性标记物的分离步骤。特别合适的是在含水介质中Brownian弛豫时间范围为10-8-10-1秒，Neelian弛豫时间大于10-8秒的。所有铁磁性或亚铁磁性胶粒为了不经过分离步骤而进行测量，所用分散介质的粘度必须与铁磁性和亚铁磁性颗粒的弛豫时间以及测量时间相匹配，因为悬浮液介质从根本上决定了Brownian弛豫的时间常数。
特别优选的是由铁，铁的氧化物，高铁酸钡，高铁酸锶、钴、镍、高铁酸镍、高铁酸钴和二氧化铬制成的铁磁性或亚铁磁性胶粒，它们的Neelian弛豫时间比Brownian弛豫时间长。
一般情况下使用颗粒大小和/或磁矩分布狭窄的磁性标记较有利。通过例如色谱法或特殊的过滤法(如玻璃毛细系统或切向过滤)、通过使用分子筛或利用离心作用可以将磁性标记分成具有窄的颗粒大小分布。通过例如在梯度磁场中分类的方法可产生磁矩尽可能一致的磁性标记。
所述的铁磁性和亚铁磁性物质可以用由寡聚或多聚糖类、蛋白质、肽、核苷酸、表面活性剂、其他单聚体、寡聚物或多聚物和/或脂质制成的外壳使之稳定。
所述的铁磁性和亚铁磁性物质的颗粒大小在1nm和400nm之间较有利，特别优选颗粒大小在1nm和100nm之间。
根据此方法，按下述测量安排进行磁力弛豫检测，首先借助于适当的磁场使欲被研究的样品的磁化成为可能，接着测量磁性标记物的磁力弛豫。实施例中所用的磁力弛豫检测分析物的测量安排示于

图1。与所有其他已知的方法形成对比(JP-235774和WO91/1Ω43)。在本发明方法的磁力弛豫测量中，不是测定磁场的存在下的静态磁化强度，而是测定在没有磁场时其随时间的变化。只有这样才可得到标记物在结合状态的数据，另外，因此也可避免抗磁或顺磁成分或杂质对测量信号的影响，而且测量的敏感性也有决定性的增高。
在磁场存在下，借助于高度敏感的传感器如SQUID，由于可适当变换的磁场，可进一步测量标记物的依赖频率的磁化强度(将复合磁化率作为频率的函数)。在这种情况下，利用了磁性标记物磁化率对频率的特殊依赖，与之相对照的是可被分别测定的顺磁或抗磁成分的频率依赖性。此方法也和WO91/15243中建议的测定超顺磁物质磁化率所用的方法有所不同。在WO91/15243中，既未描述磁性标记物磁化率的频率依赖性，也未描述使用这一特性的方法。
本发明的另一方面涉及不受血液中循环的标记物影响而能测定特异性结合的标记物的保留位点和水平的方法。在这些方法中，避免了使用放射性物质，而过去在进行现有技术中的闪烁记录法时却不能避免使用它们。
本发明的方法基于以下事实，即在液体中结合和未结合磁性标记物之间的弛豫时间有差异，以及因磁性标记物与固相的结合所致的占优势的弛豫机理的变化，所述方法也可用于磁力弛豫检测活体内的物质或结构。这种方法在下文中也被称为免疫磁强记录法。
在测量时间范围内用于人体的正在弛豫的磁性标记物空间分布的体内测量可通过两种不同的测量方法进行
1、产生有利体积的尽可能均一的磁场，关闭磁场，借助于多通道传感器测量正在弛豫的磁场的空间分布。所说传感器应尽可能完全地将测量物体封闭住。为了产生充足的测量信息，也可以用连续的光栅重复测量被测物体。
2、连续产生空间受限的局部磁场，关闭磁场，借助于单通道传感器测量正在弛豫的磁场的空间分布。也可以使用多通道传感器。
在两种方法中，为了得到尽可能多的数据，既优选测量物体的磁化强度，也优选测量所有三个空间方向上最终的磁场强度。
可通过一个模型描述上述的测量，在生物电流磁场分析中也用到此模型。本文用磁二极、多极或多-二极模型作为基础。通过适当的可将测量数据与模型参数之间的偏差降至最低的近似法可测定模型的特殊参数，尤其是二极或多极的位点。这些参数提供了有关磁化颗粒空间分布的信息。
已知一种类似的方法，经证实可用于分析生物电流的磁场。
作为适于免疫磁力记录法的方法和化合物，可使用磁力弛豫检测法所引用的所有方法和物质。
特别适于进行免疫磁力记录法的是磁性标记，它是可生物降解的并可以相容。由铁氧化物组成的磁性标记尤其有利。
为了在活体内进行结合特异性的磁力弛豫检测，在体温下引入人体体液中的铁磁性或亚铁磁性物质与结构特异性物质之联合的Brownian弛豫时间必需比Neelian弛豫时间短。
在免疫磁力记录法中，结构特异性物质被特别限定为与需被鉴定的人体组织特异性结合的所有物质。特别适合的是抗体、抗体片段、与受体特异性结合的激动剂或它们的拮抗剂，特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸，糖类或脂蛋白。在与受体结合的激动剂中，特别适合的是细胞因子、淋巴因子或内皮肽。
很适合的是结合常数范围为105-1015(mol/l)-1的所有结构特异性物质。特别适合的是结合常数范围为107-1015(mol/l)-1的所有结构特异性物质。
下述实施例被用来更详细地解释本发明的目的，而不想使它们受此目的的局限。
实施例1将100μg胶原III的单克隆抗体(下文称作抗胶原III)溶解于500μl 0.1M的碳酸氢钠溶液中，用0.1M碳酸氢钠通过Sephadex柱(Pharmacia PD10)缓冲1ml含有1mol Fe/l、颗粒大小约为40nm的葡聚糖包被的磁铁矿石悬浮液(Meito Sangyo)，在悬浮液中加入含有10mmol高碘酸钠的0.5ml溶液，将溶液在黑暗中维持2小时，然后用0.1M碳酸氢钠溶液通过PD10洗脱，在悬浮液中加入上述的抗胶原III溶液，在4℃下将混合物在黑暗中维持3小时，再加入5mg NaBH4固体并稍加旋转，4℃下将混合物在黑暗中维持8小时，再用磷酸盐缓冲的粗盐溶液(以下称为PBS，pH7.4)通过PD10柱洗脱经磁铁矿石标记的抗胶原III(下文称作磁性-抗胶原III)。
在聚苯乙烯取样管中将200μl缓冲液含5μg胶原III的溶液温育(磷酸盐缓冲的粗盐溶液(PBS)，然后弃去液相，用含有0.1％Tween(R)20的磷酸盐缓冲的粗盐溶液(下文称作PBST)将取样管冲洗三次，在样品中加入于200μl PBST中含5μl磁性-抗胶原III的溶液，在室温下温育1小时，再将样品置于超导量子干涉装置下方强度为2mT 4cm的磁场中的磁屏蔽室(见图1)磁化。关闭磁场后400毫秒，在100秒钟内进行弛豫测量，在样品中从正在消失的磁场中鉴定弛豫。含有胶原III之样品的弛豫信号示于图2。实施例2在聚苯乙烯取样管中将200μl PBS缓冲液(pH 7.4)中含5μg胶原V的溶液温育，然后弃去液相，用pH7.4的PBST洗涤缓冲液将取样管冲洗三次，在样品中加入于200μl PBST中含根据实施例1制备的5μl磁性-抗胶原III的溶液。在室温下温育1小时，再将样品置于超导量子干涉装置下方强度为2mT 4cm的磁场中的磁屏蔽室(见图1)磁化。关闭磁场后测量样品。当磁场关闭400毫秒后，在100秒钟内进行弛豫测量。在含有胶原V的样品中，在测量可信度限度内测不到正在消失的磁场(图3)。实施例3
在含有100μg胶原III的1ml PBS的溶液中加入100μl戊二醛溶液(3％的水溶液)，4℃下搅拌溶液24小时后离心。沉淀物中含有沉淀的交联胶原III。在1ml PBS中悬浮交联胶原III(样品1)。在含有100μg胶原V的1ml PBS的溶液中加入100μl戊二醛溶液(3％的水溶液)，4℃下搅拌溶液24小时再离心，沉淀物中含有沉淀的交联胶原V。在1ml PBS中悬浮交联胶原V(样品2)。在样品1和2中分别加入5μl的实施例1中的磁性-抗胶原III悬浮液，在37℃下温育1小时，然后通过SQUID检测器在强度为2mT的磁场中的屏蔽室使两种样品磁化。当磁场关闭400毫秒后，进行弛豫测量。在样品1中测到正在消失的磁场，在样品2中测不到正在消失的磁场。实施例4从10ml浓度为1.9mg/ml胶原III的PBS(pH7.4)的溶液中，制备具有下述稀释度的每份5ml的溶液10,000ng/ml，1.00ng/m l、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml。
从每份稀释液中每次移液1ml到聚苯乙烯管(2.5ml容积)中共三次，在37℃下静置1小时，然后弃去管中的内容物，将每管用1ml PBST洗涤三次。
在每管中加入按实施例1制备的1ml 1∶100稀释度的经磁铁矿石标记的抗体，将管在室温下静置1小时，再将样品经图1列出的测量安排磁化(2mT)，当磁场关闭后，在100秒钟内测量弛豫。以样品中的胶原浓度为基础，在图4中再现了对磁场关闭1200毫秒和100毫秒后测出的磁流密度之间差异的评价。实施例5将100μg胶原III的单克隆抗体(下文称作抗胶原III)溶解于500μl 0.1M的碳酸氢钠溶液中，用0.1M碳酸氢钠通过Sephadex柱(Rharmacia PD10)缓冲1ml含有1mol Fe/l和颗粒大小为大约40nm的葡聚糖包被的磁铁矿石悬浮液，在悬液中加入0.5ml 10(mmol的高碘酸钠的溶液，将溶液在黑暗中静置2小时，然后用0.1M碳酸氢钠溶液通过PD10洗脱，在悬液中加入上述的抗胶原III溶液，在4℃下将混合物在黑暗中静置3小时，再加入5mg NaBH4固体并稍加旋动，4℃下将混合物中黑暗中静置8小时，再用磷酸盐缓冲的粗盐溶液(PBS，pH7.4)通过PD10柱洗脱经磁铁矿石标记的抗胶原III(下文称作磁性-抗胶原III)。
用另外含有0.1％PBST的390μl磷酸盐缓冲的粗盐溶液(pH7.4)稀释各为20μl的磁性-抗胶原III悬浮液，将此悬浮液充入由聚丙烯酸制成的三只取样管中，每只管的容积为500μl，在第一只取样管(样品1)中加入100μl人血清白蛋白的水溶液(1mg白蛋白/ml)，在第二只取样管(样品2)中加入100μl胶原V的PBST溶液(1μg胶原v/ml)，在第三只取样管(样品3)中加入100μl胶原III的PBST溶液(1μg胶原II/ml)。加入蛋白质溶液200秒之后，按图1列出的测量安排磁化(2mT)样品，关闭磁场20毫秒之后，从1秒开始测定每只管中的磁力弛豫。在样品1和2中，在测量可信度限度内测不出正在消失的磁场，而在样品3中可测出正在消失的磁场。当取样管被倒空并各被500μl PBST冲洗三次后，重复测量，此时在测量可信度限度内所有取样管中都测不到正在消失的磁场。实施例6将100μg亲和素溶解于500μl 0.1M的碳酸氢钠溶液中，用0.1M碳酸氢钠通过Sephadet柱(Pharmacia PD10)缓冲1ml含有1mol Fe/l、颗粒大小约为404nm的葡聚糖包被的磁铁矿石悬浮液，在悬液中加入0.5ml含10mmol高碘酸钠的溶液，将溶液在黑暗中静置2小时，然后用0.M碳酸氢钠溶液通过PD10洗脱，在悬浮液中加入上述的亲和素溶液，4℃下将混合物在黑暗中静置3小时，再加入5mg NaBH4固体并稍加旋动4℃下将混合物在黑暗中静置8小时，再用磷酸盐缓冲的粗盐溶液(PBS，pH7.4)通过PD10柱洗脱经磁铁矿石标记的亲和素(下文称作磁性亲和素)。
将1mg牛血清白蛋白与生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(下文称作生物素白蛋白)偶联并用PBS稀释后浓度为1μg/ml。
室温下在聚苯乙烯取样管中将上述的1ml生物素白蛋白稀释液温育3小时，然后弃去液相，用含有0.1％Tween(R)20(PBS)的磷酸盐缓冲的粗盐溶液将取样管冲洗三次，在样品中加入5μl上述磁性亲和素，在室温下温育1小时，再将样品置于超导量子干涉装置下方强度为2mT 4cm的磁场中的磁屏蔽室中(见图1)磁化。关闭磁场后400毫秒，在100秒钟内进行弛豫测量，在样品中测到正在消失的磁场。
室温下将聚苯乙烯取样管中的1ml于PBS中的牛血清白蛋白稀释液(0.1mg/ml)温育3小时，然后弃去液相，用含有0.1％Tween(R)20(PBST)的磷酸盐缓冲的粗盐溶液将取样管冲洗三次，在样品中加入5μl上述的磁性亲和素，在室温下温育1小时，再将样品置于超导量子干涉装置下方强度为2mT 4cm的磁场中的磁屏蔽室(见图1)磁化。关闭磁场后400毫秒，在100秒钟内进行弛预测量，在测量可信度的限度内，在样品中未测到正在消失的磁场。
权利要求
1.定性和/或定量检测液相和/或固相中分析物的方法，其特征在于将铁磁性或亚铁磁性胶粒用作免疫测定法或其他结合测定法中欲被鉴定的磁性标记，它们的磁化强度的弛豫作为测量变量被测定。
2.借助于磁力弛豫测量定量检测液相和固相中分析物的方法，其中将铁磁性或亚铁磁性胶粒用作免疫测定法或其他结合测定法中欲被鉴定的磁性标记，在测量条件下，它们的Brownian弛豫进行得比Neelian弛豫更快。
3.通过测定复合磁化率作为频率的函数来定量检测液相和固相中分析物的方法，其中将铁磁性或亚铁磁性胶粒用作免疫测定法或其他结合测定法中欲被鉴定的磁性标记，在测量条件下，它们的Brownian弛豫进行得比Neelian弛豫更快。
4.定量检测液相和固相中分析物的方法，其中与分析物结合的结构特异性物质首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，然后ii)将这些经标记的结构特异性物质用于欲被测量的液体或固定化的样品，借助于外部提供的磁场使欲被测量的样品磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器测量磁性标记物磁化强度的弛豫。
5.定量检测液相和固相中分析物的方法，其中分析物首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，然后ii)将这些经磁性标记的分析物被用于欲被测量的液体或固定化的样品，在其中加入与分析物特异性结合的物质，借助于外部提供的磁场使欲被测量的样品磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器测量磁性标记物磁化强度的弛豫。
6.定量检测与固相结合的分析物的方法，其中与分析物结合的结构特异性物质首先i)被铁磁性或亚含铁磁性胶粒标记，所述胶粒在测量时间范围内会发生弛豫，藉此所述的铁磁性或亚铁磁性胶粒以下述方式被选择，即在测量条件下其Brownian弛豫的弛豫时间比Neelian弛豫的弛豫时间短，然后ii)将这些经磁性标记的物质用于欲被测量的固定化的样品，借助于外部提供的磁场，欲被测量的样品被磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器可测出磁性标记物磁化强度的弛豫，藉此将与分析物结合的磁性标记物相对于未结合的磁性标记物的不同弛豫行为用于分析。
7.根据权利要求6的方法，其中欲被鉴定的分析物需被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，所述胶粒在测量时间范围内会发生弛豫，其Brownian弛豫的弛豫时间在测量条件下比Neelian弛豫的弛豫时间短，另外在欲被测量的样品中加入与分析物特异性结合的物质，或者与分析物特异性结合的物质以固定于样品上的方式存在。
8.定量检测液相中存在的分析物的方法，其中与分析物结合的结构特异性物质首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，所述的胶粒在测量条件下的Brownian弛豫的弛豫时间比Neelian弛豫的弛豫时间要短，然后ii)将这些经磁性标记的物质用于欲被测量的样品，借助于外部提供的磁场使欲被测量的样品磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器测量磁性标记物磁化强度的弛豫，藉此将与分析物结合的磁性标记物相对于未结合的磁性标记物的不同弛豫行为用于分析。
9.根据权利要求8的方法，其中欲被鉴定的分析物需被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，所述胶粒在测量条件下的Brownian弛豫的弛豫时间比Neelian弛豫的弛豫时间短，另外在欲被测量的样品中加入与分析物特异性结合的物质。
10.根据权利要求1和4至9的方法，其中为了检测，采用了将复合磁化率为频率的函数的测量。
11.根据权利要求1至10的方法，其中结构特异性物质是抗体、抗体片段、生物素或与生物素特异性结合的物质，如亲和素和链霉亲和素，与受体特异性结合的激动剂或它们的拮抗剂，特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸、脱氧核糖核酸、糖类或脂蛋白。
12.根据权利要求11的方法，其中与受体结合的激动剂是细胞因子、淋巴因子或内皮肽。
13.根据权利要求11和12的方法，其中结构特异性物质的结合常数范围是105-1015(mol/l)-1。
14.根据权利要求11和12的方法，其中结构特异性物质的结合常数范围是107-1015(mol/l)-1
15.根据权利要求1至14的方法，其中作为磁场感受器使用了超导量子干涉装置(SQUID)、电感线圈、饱和式磁力仪、大磁阻传感器、或磁阻转换器。
16.根据权利要求1至15的方法，其中测定了一个样品中的二个或多个不同的分析物。
17.根据权利要求16的方法，其中使用了二个或多个Brownian或Neelian弛豫时间可以区分的铁磁性或亚铁磁性物质。
18.借助于磁力弛豫测量或借助于将复合磁化率作为频率的函数的测量以定量检测液相和固相中分析物的化合物，其中它们由铁磁性或亚铁磁性胶粒与结构特异性物质或欲被鉴定的物质结合组成。
19.借助于磁力弛豫测量或借助于将复合磁化率作为频率的函数的测量以定量检测液相和固相中分析物的化合物，其中它们由铁磁性或亚铁磁性胶粒与结构特异性物质或欲被鉴定的物质结合组成，其在测量条件下的Brownian弛豫进行得比Neelian弛豫更快。
20.根据权利要求1至17的方法，其中铁磁性和亚铁磁性物质的颗粒大小范围为1至400nm。
21.根据权利要求1至17的方法，其中铁磁性和亚铁磁性物质的颗粒大小范围为1至100nm。
22.根据权利要求1至17的方法，其中铁磁性和亚铁磁性物质因具有由寡聚或多聚糖类、蛋白质、肽类、核苷酸和/或脂类制成的外壳而被稳定。
23.根据权利要求18和19的化合物，其中铁磁性和亚铁磁性物质的颗粒大小范围是1至400nm。
24.根据权利要求18和19的化合物，其中铁磁性和亚铁磁性物质的颗粒大小范围为1至100nm。
25.根据权利要求18、19、23和24的化合物，其中铁磁性和含铁磁性物质因具有由寡聚或多聚糖类、蛋白质、肽类、核苷酸、表面活性剂、聚合物和/或脂类制成的外壳而被稳定。
26.根据权利要求18、19、23和24的化合物，其中结构特异性物质是抗体、抗体片段、生物素来或与生物结合的物质如亲和素和链霉亲和素、与受体特异性结合的激动剂或它们的拮抗剂，特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸，脱氧核糖核酸、糖类或脂蛋白。
27.根据权利要求1-17和20至22的方法在能育性、组织相容性、变态反应学、传染病学、卫生学、遗传学、病毒学、细菌学、毒理学、环境分析和医学诊断上的应用。
28.根据权利要求18、19、23和24的化合物在能育性、组织相容性、变态反应学、传染病学、卫生学、遗传学、病毒学、细菌学、毒理学、环境分析和医学诊断上的应用。
29.铁磁性和亚铁磁性物质与结构特异性物质的结合或铁磁性或亚铁磁性物质与欲被鉴定的分析物的结合在根据权利要求1-17和20至22的方法中的用途。
30.用磁力弛豫检测引入人体的铁磁性或亚铁磁性胶粒的方法，其中所述这些颗粒磁化强度的Neelian弛豫是在关闭磁场后测定的。
31.免疫磁力记录方法，其中结构特异性物质首先i)被铁磁性或亚铁磁性胶粒标记，然后ii)这些经标记的结构特异性物质被引入活的生物体，借助于外部提供的磁场，使所研究的生物体磁化，当外部磁场关闭后，借助于磁场感受器测量磁性标记物磁化强度的弛豫。
32.根据权利要求30和31的方法，其中结构特异性物质是抗体、抗体片段、生物素或与生物素特异性结合的物质，如亲和素或链霉亲和素，与受体特异性结合的激动剂或它们的拮抗剂，特殊的肽和蛋白质、受体、酶、酶底物、核苷酸、核糖核酸，脱氧核糖核酸、糖类或脂蛋白。
33.根据权利要求32的方法，其中与受体结合的激动剂是细胞因子、淋巴因子或内皮肽。
34.根据权利要求32和33的方法，其中结构特异性物质的结合常数范围是105-1015(mol/l)-1。
35.根据权利要求32和33的方法，其中结构特异性物质的结合常数范围是107-1015(mol/l)-1。
36.根据权利要求30至35的方法，其中作为磁场感受器使用了超导量子干涉装置(SQUID)、电感线圈、饱和式磁力仪、大磁阻传感器或磁阻转换器。
37.根据权利要求30至36的方法，其中将复合磁化率作为频率的函数的测量取代了弛豫测量。
38.根据权利要求17和21至24的化合物在根据权利要求30至37的方法中的用途。
39.铁磁性或亚铁磁性物质与结构特异性物质的结合在根据权利要求30至37的方法中的用途。
40.在根据权利要求30-37的方法中使用的化合物，其中它们由可生物降解的铁磁性或亚铁磁性物质与结构特异性物质结合组成。
41.在根据权利要求30-37的方法中使用的化合物，其中它们由可生物降解的铁磁性或亚铁磁性物质与结构特异性物质结合组成，在体温下，体液中所述铁磁性或亚铁磁性物质与结构特异性物质之结合的 Brownian弛豫时间比Neelian弛豫时间短。
42.根据权利要求41的化合物，其中铁磁性或亚铁磁性物质是可生物降解的氧化铁。
全文摘要
本发明涉及定量磁力弛豫检测液相和固相中之分析物的方法,磁力弛豫检测所用的化合物,以及它们在分析和免疫磁力记录法中的用途。
文档编号G01N27/72GK1176001SQ96191613
公开日1998年3月11日 申请日期1996年1月29日 优先权日1995年1月27日
发明者沃纳·魏特席斯, 罗曼·科蒂茨, 卢茨·特拉姆斯, 托马斯·帮特 申请人:舍林股份公司