专利名称：使用三核苷酸重复序列诊断神经精神疾病的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是使用三核苷酸重复序列诊断神经精神疾病的方法及试剂盒。更具体地说，本发明涉及基因扩增方法和反向斑点杂交(reversedot hybridization)及寡核苷探针技术。本发明的方法和探针是具体来说与检测SCAIII基因有关。本发明涉及分子生物学，诊断医学领域。
背景技术：
神经精神性疾病很难诊断和治疗，因为它们的病因及发病机制还不清楚。近来发现一些神经精神疾病与特定的基因有关。因此，利用这些基因准确诊断这类疾病方面已进行了大量的研究。
三核苷酸重复序列(TNR)是微卫星DNA，这些DNA在基因组中以3-bp前后串联方式重复出现。人类遗传学尤其关注这些微卫星DNA，因为它们的长度因人而异，使其在一些遗传疾病的基因图谱和临床诊断或预测方面非常有用，尤其是神经精神疾病。例如，正常个体的基因组DNA有数十个拷贝的TNR。而据报道神经精神疾病的患者，其特定的TNR与正常个体相比增加几倍到上百倍。
1991年，在脆性X染色体综合征患者的基因组中首次报道了CGG重复序列数目的增加。从此，有关三核苷酸序列增多的类似疾病有很多报道，包括在1996年报道的friedreich’共济失调，1997年报道的SCAVI和SCAVII综合征。现在发现13种疾病与三核苷酸重复序列增多有关。
脆性X染色体综合征的一项研究将患者染色体Xq27.3(FRAXA)基因座克隆，这项研究揭示在患者中FRAXA数目增加是常见的现象(Yu，S.etal.，Science，2521179-1181，1991)。另外，三核苷酸重复序列增多也出现于肌强直性营养不良的个体，造成不稳定的有丝分裂而导致体细胞镶嵌。
另外，TNR增多相关的疾病还包括Huntington’s疾病，脊髓小脑共济失调一型(SCAI)，X联锁的脊髓延髓萎缩(SBMA)，dentatorubraland pallidoluysian萎缩(DRPLA)，脊髓小脑共济失调三型(SCAIII)和FRAXE智力发育迟缓。
近来分子遗传学提供很好的证据说明一些遗传性神经精神疾病主要归因于TNR数目的增加。这些包括TNR的基因的表达产物被认为是在脑内起重要作用的激酶，但是，TNR与发病机制的相关性还没有搞清楚。
由TNR增多引起的疾病具有相对常见的临床表现。具体地说，这类疾病具有四种常见的临床表现早现遗传现象，遗传倾向(常染色体显性和性染色体显性)，神经退行性变或智力发育迟缓，体细胞镶嵌。
早现遗传现象是遗传性疾病在谱系的较近世代中显示出发病更早，病情更重的一种现象。即病情在每一代都加重。例如，肌强直性营养不良在一个三代家庭中各代的表现不同。祖父在六七十岁发病，父亲在三四十岁发病，孙子在十几岁发病。DNA序列分析显示正常个体中CGG重复序列单位出现50或50以下的拷贝。那些患有脆性X染色体综合征的个体出现200或更多的CGG重复序列单位。正常的携带者是那些携带基因而不发病的个体，即智力正常而观察不到典型患者的表现，正常携带者中具有中等数量的重复序列，从60到200不等。当正常携带者传递基因给下一代时，常出现重复序列增多，从60-200增加到200以上。脆性X染色体综合征除了智力发育迟缓以外，还有以下特点面容异常、耳大、男性青春期后的巨睾症。大多数与TNR增多相关的疾病都观察到以上情况，所以对这类疾病的预测是可能的。
作为遗传学中一个所谓动态突变(dynamic mutation)的例子，常染色体显性或性染色体显性遗传是一种现象，其中的遗传信息本该在连续的各代保持一致，但遗传信息就在其下一代发生改变。
神经退行性变或智力发育迟缓正是患者到医院就医的原因。智力发育迟缓是fragile X或FRAXA综合征的主要症状，肌强直性营养不良的主要症状是进行性肌肉病变恶化引起的肌张力下降，其它疾病的主要症状是共济失调。所以，神经精神性疾病可以通过检测那些有症状出现的患者的基因来诊断。
神经精神性疾病的一个特点-体细胞镶嵌是通过患者基因的southern杂交和甲基化分析来检测的，例如，脆性X染色体综合征患者或其家庭的检测结果是除了一条正常的单一条带以外还出现一弥散条带，这一结果显示CGG重复序列单位数目的增加在各代间是不同的。这要归因于以下事实，即CGG重复序列单位的数目因为有丝分裂和减数分裂而出现不同程度的增加。据报道，脆性X染色体综合征患者的各器官间也具有不同的CGG重复序列单位数目。这样就使得我们很难在产前通过绒毛标本来准确诊断脆性X染色体综合征。事实上，尽管在外周血中很明显，但据报道异常甲基化通过产前诊断并没有检测到。
由于TNR数目增加引起的神经精神性疾病有一个共同点，即基因重复序列存在于几乎所有病人相同的基因位点上。神经精神性疾病的一个原因-基因突变看起来是来源于相同的祖先(建立者效应，foundereffect)，因为它可归因于某一特定基因位点上的异常。相反，引起马凡氏综合征的突变或常染色体显性遗传的遗传性肥厚性心肌病的突变在很多外显子上都可见到。例外的是，发现脆性X染色体综合征是一个外显子的突变引起的，而不是TNR序列引起的。然而，几乎所有的神经精神性疾病都是某一基因位点的突变引起的。
连锁分析显示导致神经精神性疾病的基因包含数目增多的TNR从而在染色体上出现相同的多态性标记。
神经精神性疾病是某一基因上TNR数目增加这一简单机制引起的，利用这一事实可以临床诊断神经精神性疾病。也就是说，可以通过检查TNR数目增多的程度而不是所有的外显子突变来高度准确地检测神经精神性疾病。脆性X染色体综合征可常规地通过检查来自可疑个体细胞的X染色体而确定并达到50％的准确性，其中的细胞是在缺少叶酸的培养基中培养的。
检测与神经精神性疾病相关的TNR的方法已经建立并获得专利(U.S.Patent Nos.5,545,549，5,650,277，5,597,694，5,723,301 and5,582,979，and WO 97/27382)。尤其是与亨廷顿氏病相关的基因已获专利(General Hospital Ccrporation；U.S.Patent Nos.5,538,844，5,686,288 and 5,693,757 and EP No.0 814 977)。然而，用含有TNR的基因座位进行反向斑点杂交或聚合酶链反应-微量板杂交(PCR-MPH)的方法来诊断神经精神性疾病还没有任何报道。
应用这些分子遗传学方法可以精确地诊断神经精神性疾病。尤其是改良的斑点杂交方法反向斑点杂交，因为是在一个膜上或板上使用多个探针一次操作，可望成为医院里有用的常规筛选方法，这种方法是将探针在膜上或板上固定后，待测DNA与探针杂交并进行定量分析。
使用PCR和反向斑点杂交进行HLA分型的方法已经建立起来，而且，日本Wakunaga公司已申请专利(Japanese Pat.Appl’n No.Heisei8-83480)。然而，用此方法诊断神经精神性疾病还没有报道。
发明内容
发明人彻底而深入研究的目的是建立有效诊断神经精神性疾病的方法，结果发现神经精神性疾病相关基因含有三核苷酸重复序列，通过反向斑点杂交或PCR-MPH，含有疾病相关基因的质粒载体被用来准确而简易地诊断神经精神性疾病。
因此，本发明的一个目的是克服现有技术中存在的问题并提供一种诊断神经精神性疾病的方法，可用作医院中的常规准确的筛选方法。
本发明的另一个目的是提供一种诊断遗传性神经精神性疾病的试剂盒，用试剂盒可准确地诊断疾病并判断其严重性。
本发明的一个方面是提供了一种诊断SCAIII综合征的方法，这种方法包括以下步骤将含有73拷贝CAG重复序列单位的一段SCAIII基因与底物结合；在适宜的条件下，用两条标记引物，通过PCR来扩增取自受检者基因组DNA中含有三核苷酸重复序列的一段DNA片段；DNA扩增的PCR产物与基因杂交；分析杂交结果。
本发明的另一个方面是提供了一种诊断SCAIII综合征的试剂盒，这种试剂盒包括与含有73拷贝CAG重复序列单位的一段SCAIII基因相结合的底物；可检测标记物标记的两个引物，这两个引物用来扩增受检者基因组DNA中含有三核苷酸重复序列的一段DNA片段；PCR反应缓冲液和聚合酶；杂交缓冲液；显色酶。
本发明的试剂盒中，神经精神性疾病相关基因是一段或全部含TNR基因的质粒载体，寡核苷酸或DNA片段，底物包括膜或微量板，可检测的标记物包括32P同位素标记或生物素标记。
本发明的试剂盒还包括洗脱缓冲液，亲和素偶联的酶和发色底物，优选地，亲和素偶联的酶是链亲和素-碱性磷酸酶。
具体地说，SCAIII基因被用作含TNR的基因，两个寡核苷酸SEQ IDNo.1(5’-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3’)和SEQ ID No.2(5’-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’)被用作引物。
本发明另一方面提供了一种质粒载体-pSCAIII 73，其保藏号为No.KCTC0435BP，这种质粒含有来自SCAIII综合征患者基因组的一段SCAIII基因。
本发明再一方面提供了一种质粒载体pSCAIII 8，它含有来自正常个体基因组的一段SCAIII基因。
附图
简介图一显示质粒载体pSCAIII 8，pSCAIII 22，pSCAIII 73的构建示意图。
图二显示使用质粒载体pSCAIII 8，pSCAIII 22，pSCAIII 73与患者和正常个体进行反向斑点杂交的结果。
A使用正常个体的PCR产物 B使用SCAIII患者的PCR产物图三显示本发明MPH的原理。
实施本发明的最佳方案本发明涉及使用TNR对遗传性神经精神性疾病的诊断。为此，使用了反向斑点杂交和PCR-MPH技术。
斑点印迹杂交中PCR产物被印在膜上，接着与探针杂交，质粒探针被印在膜上，接着与在反向斑点杂交中标记的PCR产物进行杂交。
以SCAIII为例，以下详细描述一种新的诊断方法和试剂盒。
SCAIII综合征是一种神经精神性疾病，这种疾病是由多聚谷氨酰胺基因上三核苷酸重复序列CAG数目增多造成的。正常个体的染色体有13-34拷贝的三核苷酸重复序列，而病人有68-79拷贝。
首先，用怀疑患有SCAIII综合征个体的染色体14q24.3位点上的SCAIII基因检查发现TNR数目增多。然后，如图一所示，SCAIII基因的一个区段通过PCR扩增后被插入到一个质粒上。患有SCAIII综合征个体的SCAIII基因被克隆到质粒载体pCR II 2.1-TOPO上的EcoR I限制性酶切位点上，PCR II 2.1-TOPO购自Promega。
得到的质粒载体称为pSCAIII 73并于1998年1月23日根据布达佩斯条约保藏在韩国典型微生物保藏中心(保藏号为KCTC 0435 BP)。同样将正常个体的SCAIII基因插入质粒载体PCRII 2.1-TOPO而得到质粒载体pSCAIII 22和pSCAIII 8。这样正常个体和患病个体的含有TNR的SCAIII基因部分或全部地插入了质粒，所有这些质粒都在本发明的范围之内。
根据本发明，与TNR增多相关的神经精神性疾病可通过反向斑点杂交技术来诊断，为此将制备的含有TNR的质粒转移到尼龙膜上，然后，与使用提取自患者的DNA模板以及带有可检测标记的引物而获得的PCR产物杂交。杂交产物通过放射自显影或显色等方法来分析。
至于PCR反应的引物，它们是用放射性同位素或生物素标记的两条与受检双链DNA3’末端互补的合成寡核苷酸。根据本发明，被检患者含有TNR的SCAIII基因片段使用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行扩增。杂交是在含有6×SSC，5×Denhart溶液，0.1％鲑精DNA的缓冲液中进行的。
使用正常个体的质粒载体pSCAIII 22和pSCAIII 8和患有神经精神性疾病个体的质粒载体pSCAIII 73，通过放射自显影或显色反应都可得到明显的信号(图二)。这样，该方法可用于诊断一个人是否患有神经精神性疾病并了解疾病的严重性。
从被检个体的血液可获得PCR模板，将从血中分离的基因组DNA经过PCR扩增得到目标片段。这一DNA片段被加到固定有pSCAIII 8和pSCAIII 73的膜或板上。如果从质粒载体pSCAIII 8检测出明显的信号则该个体是正常的。另一方面，如果从质粒载体pSCAIII 73检测出明显的信号则他或她是患者。
进行PCR-MPH时，含有TNR的探针首先在微量板的孔中被固定。含有TNR的目标DNA片段，连同生物素标记的引物一起上PCR仪。扩增的DNA片段与固定的探针杂交。杂交后，微量板用缓冲液冲洗并加入链亲和素-碱性磷酸酶和发色底物。通过测定450nm吸收可以定量分析酶反应的不同颜色。
作为探针，它含有与神经精神性疾病相关的DNA片段，和含有具有上述DNA片段的前后相连的单链DNA。为了作为PCR-MPH中的引物，这些寡核苷酸含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的碱基序列并用32P或生物素标记在寡核苷酸的5’末端。
正如以上所述，本发明的反向斑点杂交和PCR-MPH可应用不同的引物和探针来诊断所有的遗传性神经精神疾病。
以下展示的例子可用来更好地理解本发明，而不是限制本发明。
比较实施例一Southern杂交本例中，使用常规的Southern杂交技术来诊断神经精神性疾病。
从患有神经精神性疾病家族的各个成员的外周血中分离出总DNA。这样获得的总DNA用EcoR I消化并在0.7％的琼脂糖凝胶中进行电泳。分离的DNA片段通过杂交被转移到尼龙膜上，如购自Amersham商品名为Hybond N的尼龙膜。在65℃环境下用含有6×SSC，5×Denhart溶液，0.1％鲑精DNA的缓冲液进行杂交，含有SCAIII基因3’末端的质粒载体作为探针，用随机引物法标记上(α-32P)dATP。杂交过程持续进行12-18小时。缓冲液冲洗后，将膜进行放射自显影。
实例一反向斑点杂交从证明是SCAIII患者的外周血中分离出总DNA。使用总DNA为模板进行PCR反应来扩增SCAIII DNA区，然后，PCR产物(SEQ ID No.3)按如下方法被插入一个质粒载体上，PCR产物的具体序列如下。CCA GTG ACT ACT TTG ATT CGT GAA ACA ATG TAT TTT CCT TAT GAA45TAG TTT TTC TCA TGG TGT ATT TAT TCT TTT AAG TTT TGT TTT TTA90AAT ATA CTT CAC TTT TGA ATG TTT CAG ACA GCA GCA AAA GCA GCA135A CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 181CAG CAG CAG CAG CAG CAG GAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 226CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 271CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 316CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CGG GAC 361CTA TCA GGA CAG AGT TCA CAT CCA TGT GAA AGG CCA 397SCAIII的PCR产物用EcoR I消化后插入到同样用EcoR I酶切的质粒载体PCRII 2.1-TOPO而产生一个新的载体，被称作pSCAIII 73。对于正常个体，重复上述制备患者载体的过程，结果获得了两个重组质粒，被称作pSCAIII 22和pSCAIII 8。
利用印迹方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning)，将所有的质粒转移到尼龙膜上，这些商品名为Hybond N的尼龙膜购自Amersham。按以下实例二的方式进行PCR扩增SCAIII DNA区，其中，来自受检者的DNA作为模板，含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2碱基序列用32P或生物素标记的寡核苷酸作为引物。然后，按比较实例一的方式将PCR产物与印迹的质粒载体杂交，接着，杂交物进行放射自显影和显色分析。
对于正常个体，印有pSCAIII 22和pSCAIII 8的膜显示很强的信号，而对于病人来说，印有pSCAIII 73的膜显示很强的信号。因此，就可诊断是否患病和疾病的严重程度。
实例二聚合酶链反应从患者外周血中分离出基因组DNA作为模板进行PCR来扩增SCAIII基因的TNR序列，两条寡核苷酸作为引物，一条的碱基序列是5’-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3’(SEQ ID No.1，MJD52)和另一条的碱基序列是5’-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’(SEQ ID No.2，MJD25)。这两条引物已经在Nature Gentics Vol.8，pp221-228(1994)发表.。
混合基因组DNA100ng，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2各0.5μM，dATP，dGTP，dTTP，各200μM，dTTP50μM，Ci(α-32P)-dCTP 0.3μ，加入1×PCR缓冲液(50mM氯化钾，10mMTris-Hcl PH8.3，1.5mM氯化镁)至终体积20μl。以上混合物于95℃变性5分钟后加入2U Taq酶来热启动。PCR进行30个循环，其中，每一次变性过程为95℃1分钟，每一次退火过程为55℃1分钟，每一次延伸过程为72℃1分钟。
由此得到的PCR产物上测序胶(6％聚丙烯酰胺/8M尿素)进行电泳来确定碱基序列。
实例三用TNR进行PCR-MPH含有具有TNR的前后相连的探针的ssDNA在微量板上固定。在微量板中加入受检者的基因组DNA。在微量板孔中用5’末端标有生物素的序列I和序列II作为引物进行PCR反应来扩增SCAIII基因区。得到的PCR产物进行杂交。随后，用TMAC缓冲液进行冲洗(3M氯化四铵，50mM Tris-HclPH7.5，2mM EDTA)。加入显色底物和链亲和素-碱性磷酸酶与PCR产物反应。样品孔在450nm的吸光度可通过微量板读数仪进行观察。(图三)神经精神疾病SCAIII综合征可通过检测SCAIII基因特征性的TNR数目增多的程度而有效地进行诊断，检测TNR数目是利用反向斑点杂交或PCR-MPH进行的。用分子遗传学方法分析TNR数目来诊断神经精神疾病的准确性可达到99％或更高，比其他方法的准确性高。正常携带者，即那些带有问题基因而不发病者，比正常个体拥有更多TNR拷贝。TNR数目越多，疾病越严重。根据以上事实，可以进行神经精神疾病的预测研究，这种研究对治疗疾病很有帮助。所以，本发明提供的方法可进行神经精神疾病的诊断也可以对神经精神疾病家族的成员是否会患病进行预测诊断。另外，本方法可推测出何时会患病或发病程度如何，所以，该方法可作为神经精神疾病诊断和治疗的通用筛选方法。
已经用示例性方法描述了本发明，本发明使用的术语应该理解为具有描述的性质而不是进行限定。依照以上叙述，可对本发明进行改进和变化。所以，本发明的范围由以下权利要求限定，而不局限于具体叙述。
序列表(1)一般信息(i)申请人SAMAUNG FINE CHEMICALS CO.，LTD.
JIN，Dong Kyu(ii)发明名称使用三核苷酸重复序列诊断神经精神疾病的方法和试剂盒(iii)序列数3(v)计算机可读形式(A)类型软盘(B)计算机兼容IBM PC(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件KOPatentIn#1.0(vi)本申请数据(A)申请号未知(B)申请日本文提交日(C)分类未知(viii)律师/代理人信息(A)姓名KIM，Dong Wan(B)登记号码544(C)参考/文档号MK-66/SS/PCT(ix)电信信息(A)电话82-2-553-1062(B)电传82-2-569-2522(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.1
CCAGTGACTA CTTTGATTCG(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度22bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.2TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度397bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID No.3CCA GTG ACT ACT TTG ATT CGT GAA ACA ATG TAT TTT CCT TAT GAA 45TAG TTT TTC TCA TGG TGT ATT TAT TCT TTT AAG TTT TGT TTT TTA 90AAT ATA CTT CAC TTT TGA ATG TTT CAG ACA GCA GCA AAA GCA GCA 135A CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 181CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 226CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 271CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG 316CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CGG GAC 361CTA TCA GGA CAG AGT TCA CAT CCA TGT GAA AGG CCA 39权利要求
1.诊断SCAIII综合征的方法，包括以下步骤将含有73拷贝三核苷酸重复序列单位(CAG)的一段SCAIII基因(SEQID NO3)连接到底物上；在适当的条件下，用两个标记的引物(SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2)，将取自受检者基因组DNA含有三核苷酸重复序列单位的DNA进行PCR扩增；DNA扩增的PCR产物与基因杂交；分析杂交结果。
2.SCAIII综合征的诊断试剂盒，包括与含有73拷贝三核苷酸重复序列单位(CAG)的一段SCAIII基因(SEQID No.3)相连的底物；可检测标记物标记的两个引物，这两个引物是用来扩增受检者基因组DNA中含有三核苷酸重复序列单位的一段DNA片段；PCR反应缓冲液和聚合酶；杂交缓冲液；显色酶。
3.权利要求2中所说的诊断试剂盒，其中的SCAIII基因以质粒载体，寡核苷酸或DNA片段形式存在。
4.权利要求2中所说的诊断试剂盒，其中的底物包括膜或微量板。
5.权利要求2中所说的诊断试剂盒，其中的可检测标记物包括32P放射性标记或生物素标记。
6.权利要求2中所说的诊断试剂盒，还包括洗脱缓冲液，及亲和素偶联的酶和生色底物。
7.保藏号为KCTC0435BP的质粒载体pSCAIII 73，其包括从SCAIII综合征患者基因组中制备的一段SCAIII基因(SEQ ID No.3)。
8.质粒载体pSCAIII 8，其包括来自正常个体基因组的一段SCAIII基因。
全文摘要
本发明公开了一种诊断SCAⅢ综合征的方法及试剂盒。本方法包括将含有73拷贝三核苷酸重复序列单位(CAG)的一段SCAⅢ基因与底物结合;在适当的条件下,用两个被标记的引物将取自受检者基因组DNA含有三核苷酸重复序列单位的DNA进行PCR扩增;DNA扩增得到的PCR产物与基因杂交;分析杂交结果。SCAⅢ综合征患者可通过检测疾病相关基因特征性的TNR数目增多的程度而有效地进行诊断,检测是利用反向斑点杂交或PCR－MPH进行的。可用于诊断的试剂盒包括底物、两个带有可检测标记物的引物,这两个引物是用来扩增取自受检者基因组DNA含有三核苷酸重复序列单位的一段DNA片段的,还包括PCR反应的缓冲液和聚合酶、基因杂交的缓冲液和显色的酶。
文档编号G01N33/53GK1256714SQ99800161
公开日2000年6月14日 申请日期1999年2月18日 优先权日1998年2月26日
发明者陈东奎 申请人:三星精密化学株式会社, 陈东奎