,定容为500ml。
[0047] 实验方法（流程图见图1)
[0048] 芯片的预处理
[0049] 1、每孔中加入 200 μ L Binding Buffer。
[0050] 2、摇床上振荡（500rpm，室温）5分钟使充分平衡后去除液体，重复平衡一次。
[0051] 血清的预处理
[0052] 1、冰浴上缓慢融解血清（30~60分钟），1000 Orpm离心5分钟（4°C )。
[0053] 2、10 μ LU9血清变性溶液中加入血清5 μ L，摇床上振荡使充分混合（600rpm，4°C， 30分钟）。
[0054] 3、用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200 μ L用于上样，摇床上振荡使 充分混合（600rpm，4°C，2分钟）。至此血清被稀释约40倍。
[0055] 蛋白质与芯片结合
[0056] 1、取上述经U9处理并稀释过的血清100 μ L加到芯片上，仔细检查并去除每个孔 中的气泡以免其影响蛋白质与芯片的结合。
[0057] 2、芯片与血清充分反应1小时（600rpm摇床上振荡，4°C )后去除样品。
[0058] 结合后冲洗
[0059] 1、每孔加入200 μ L相应的Binding Buffer，摇床上振荡5分钟（600rpm，室温） 后除去液体，重复该过程2次。
[0060] 2、用水（纯度HPLC级）200 yL快速清洗每个孔1次，用力甩干并将Bio-processor 倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。
[0061] 3、将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥。
[0062] 加能量吸收分子（EAM)
[0063] 每孔点加 50%饱和的SPA溶液1 μ L，待其自然干燥后重复点加 1次。自然干燥即 可上机检测。
[0064] 数据采集及统计学处理
[0065] SELDI质谱仪参数设置及原始数据采集和输出
[0066] 首先用已知分子量的标准蛋白质芯片Al Ι-in-One将SELDI质谱系统的分子 量误差校正到<〇. 1%，再将结合好蛋白质的芯片放入质谱仪中进行检测。原始数据 由Proteinchip Software 3. 2软件采集，设置激光强度为180,检测灵敏度6,检测上限 100. 000m/z，优化收集数据范围2000~20000m/z，信号收集位置从20~80,每个样本取 168个点所收集信号的平均值。用Proteinchip Software 3. 2软件将原始数据以xlm的格 式输出。
[0067] 数据处理
[0068] 采用 ZJU-PDAS (ProteinChip Data Analyze System)软件分析，整个流程如下：
[0069] 1、原始质谱图上传到服务器。
[0070] 2、先用小波变换（UDWT undecimated discrete wavelet transform)去除质谱仪 器本身造成的噪音。
[0071] 3、修正去除噪音后的质谱图的基线。
[0072] 4、校正整个图谱的分子量值。
[0073] 5、用局部极值法找出蛋白值峰，用信噪比和这个峰在各个样本中出现的比率过滤 蛋白质峰。
[0074] 6、均一化所有样本数据。
[0075] 7、对预处理完筛选出来的蛋白质峰做进一步的检验分析，筛选出P < 0. 05差异蛋 白峰。
[0076] 8、对筛选的差异蛋白峰进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选最佳 模型，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组 合作为最终的候选标志物，建立的模型和留一法交叉验证的结果作为最终的结果。
[0077] 9.输出各种统计结果和图片。
[0078] 结果：
[0079] 1、早期胰腺癌组（阳性组）vs健康人对照组
[0080] 22例早期胰腺癌组和20例健康人对照组进行t检验，筛查P值小于0. 05的差异 蛋白质。共检测到153个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰，发现有14个蛋白 质峰含量有统计学差异（P < 〇. 05)，从中筛选出11个蛋白质峰用于建立SVM判别模型。所 有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图见图2。两组样本支持向量机散点分布图，见图3， 每一点表示一个样本，纵坐标为主成分，横坐标为SVM预测值，两组可清晰的区分。
[0081] 表1 P值小于0. 05的所有14个峰的统计结果
[0082]
【主权项】
1. 一种早期诊断的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物包括多个蛋白质质荷比 峰组成：6668Da、859IDa、412IDa、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da 和 5346Da。
2. -种早期诊断的肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括： 步骤1 :血清准备，无影响血清中蛋白质含量的其他相关疾病，于清晨空腹采集健康人 及患者治疗前外周静脉全血5ml，5°C静置1~2h，3000r/min条件下离心10min，分离血 清，-60°C下冰箱保存备用； 步骤2 :质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断 丰旲型； 步骤3 :进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。
3. 如权利要求2所述的一种早期诊断的肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述步 骤2中：质谱数据收集设置激光强度为190,检测灵敏度为5,检测上限为100000m/ Z，收集 数据范围为2000~20000m/z，信号收集位置从20~80。
4. 一种早期诊断的肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型，其特征在于，所述血清肿 瘤标志物由10个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、859IDa、6471Da、877roa、4290Da、 6655Da、2959Da、5913Da和5346Da，所述蛋白质指纹图诊断模型按下述方法建立： 步骤1 :利用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本 的蛋白质组图谱； 步骤2 :结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
【专利摘要】本发明提供一种早期诊断的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物包括多个蛋白质质荷比峰组成：6668Da、859IDa、412IDa、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。本发明还提供一种早期诊断的肿瘤标志物的检测方法和诊断模型。采用本发明提供的早期诊断的肿瘤标志物、检测方法和诊断模型带来的有益效果为：联合在血清中筛选的候选的肿瘤标志物，对胰腺癌患者的早期诊断提供新的途径和方法，弥补了影像学的不足，促进了影像学技术的进步及相关的支持向量机等生物信息学软件的开发和应用，在早期胰腺癌患者诊断方面取得了一定的突破，提高了诊断的准确率。
【IPC分类】G01N27-64
【公开号】CN104677979
【申请号】CN201510095651
【发明人】董新军, 刘飞艳, 董亚群, 赵中华
【申请人】董新军
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月4日