一种早期诊断的肿瘤标志物、检测方法和诊断模型的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学诊断领域，特别涉及一种对早期诊断灵敏度、特异性高的肿瘤标 志物、检测方法和蛋白质指纹图诊断模型。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一，胰腺癌患病率和病死率迅速上升， 发病年龄逐渐提前已引起普遍关注。由于临床上缺乏好的肿瘤标志物检测方法，绝大多数 的胰腺癌患者确诊时已是中晚期。早期诊断、早期治疗是提高胰腺癌生存率和降低死亡率 的关键。但是目前，胰腺癌早期诊断缺乏有效手段，目前主要手段靠影像学检查，但结果不 尽人意。在早期阶段，尤其是亚临床阶段CT、MR则无能为力。肿瘤标志物的诊断是近年来 研宄的热点。然而单一的肿瘤标志物往往难以反映肿瘤的全貌，从理论上讲，最有可能成为 理想肿瘤标志物的应是联合数个或多个的肿瘤标志物。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术存在的问题，为了提高早期诊断水平，从而有助于改善肿瘤患 者的预后，本发明的目的之一旨在建立肿瘤早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，进一步可 筛选出肿瘤早期诊断的新的体液蛋白质肿瘤标志物。
[0004] 本发明提供的一种早期诊断的肿瘤标志物采用的主要技术方案为：所述肿瘤标 志物包括多个蛋白质质荷比峰组成：6668Da、859IDa、412IDa、8775Da、4290Da、6655Da、 2959Da、5913Da和 5346Da。
[0005] 本发明提供的一种早期诊断的肿瘤标志物的检测方法采用的主要技术方案为：所 述检测方法包括：
[0006] 步骤1 :血清准备，无影响血清中蛋白质含量的其他相关疾病，于清晨空腹采集健 康人及患者治疗前外周静脉全血5ml，5°c静置1~2h，3000r/min条件下离心10min，分离 血清，-60°C下冰箱保存备。
[0007] 步骤2 :质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图 诊断模型。
[0008] 步骤3 :进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。
[0009] 本发明提供的早期诊断的肿瘤标志物的检测方法还可具有如下附属技术特征：
[0010] 所述的步骤2中：质谱数据收集设置激光强度为190,检测灵敏度为5,检测上限为 100000m/z，收集数据范围为2000~20000m/z，信号收集位置从20~80。
[0011] 本发明提供的一种早期诊断的肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型采用的主要 技术方案为：所述血清肿瘤标志物由10个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、859IDa、 6471Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da 和 5346Da，所述蛋白质指纹图诊断模型按 下述方法建立：
[0012] 步骤1 :利用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清 标本的蛋白质组图谱。
[0013] 步骤2 :结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
[0014] 采用本发明提供的早期诊断的肿瘤标志物、检测方法和诊断模型带来的有益效果 为：
[0015] 1、利用SELDI-TOF-MS技术从低丰度的血清样本中检测出血清肿瘤标志物。
[0016] 2、联合在血清中筛选的候选的肿瘤标志物，对胰腺癌患者的早期诊断提供新的途 径和方法，弥补了影像学的不足，促进影像学技术的进步，在早期胰腺癌患者诊断方面取得 了 一定的突破。
[0017] 3、促进相关的支持向量机等生物信息学软件的开发和应用，提高诊断的准确率。
[0018] 4、本发明从一个崭新的技术平台和理念检测胰腺癌的联合蛋白质肿瘤标志物，可 望提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后。
【附图说明】
[0019] 图1所示为本发明实验方法的流程示意图。
[0020] 图2所示为本发明所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图。
[0021] 图3所示为本发明早期胰腺癌组与健康人对照组两组样本支持向量机散点分布 图。
[0022] 其中，纵坐标principal component表不主成分，横坐标SVM predict labels表 示支持向量机预测值，SVM Result Scatter Plot表示支持向量机散点分布结果。
[0023] 图4所示为本发明所有样本的质谱表达图。
[0024] 图5所示为本发明人胰腺癌血清样本与相应羊抗人抗体反应过夜后经SELDI检测 结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下文将结合具体实施例对本发明做进一步描述。应当注意的是，下述实施例中描 述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到 更好的技术效果。
[0026] 图1所示为本发明实验方法的流程示意图。
[0027] 图2所示为本发明所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图。
[0028] 图3所示为本发明早期胰腺癌组与健康人对照组两组样本支持向量机散点分布 图。
[0029] 其中，纵坐标principal component表不主成分，横坐标SVM predict labels表 示支持向量机预测值，SVM Result Scatter Plot表示支持向量机散点分布结果。
[0030] 图4所示为本发明所有样本的质谱表达图。
[0031] 图5所示为本发明人胰腺癌血清样本与相应羊抗人抗体反应过夜后经SELDI检测 结果图。
[0032] 实施例1
[0033] 1、样本和资料
[0034] 胰腺癌患者：共54例（早期22、晚期32)，术后病理确诊，平均年龄65岁。
[0035] 健康对照组：共20例，来源于体检，平均年龄为63岁。
[0036] 共分两组进行血清的蛋白质谱分析对比：
[0037] ①早期胰腺癌组vs健康人对照组，②早期胰腺癌vs晚期胰腺癌组。
[0038] 各组年龄和性别均配对，有相似的暴露史，无影响血清中蛋白质含量的其他相关 疾病，于清晨空腹采集健康人及患者治疗前外周静脉全血5ml，5°C静置I. 5h，3000r/min条 件下离心10min，分离血清，-60°C冰箱保存备用。
[0039] 2、实验方法
[0040] 主要仪器设备及试剂：
[0041] Ciphergen PBS-II-PLUS 型 SELDI-TOF-MS 系统。
[0042] 蛋白质芯片：CMlO芯片。
[0043] 实验试剂的配制：
[0044] 1、邯血清变性溶液：8111〇1/1尿素，2%(：祖?3，1%01'1'。配制完成后分装，-60°〇下 低温冰箱保存。
[0045] 2、50%饱和 SPA 溶液：SPA 的溶剂为 50% H20+50% 乙腈 +0· 5% TFA。将 SPA 溶解 于其溶剂中直至过饱和，13. OOOrpm离心1分钟后取上清液，与溶剂I : 1混合即可。室温 避光保存。
[0046] 3、CM10 芯片 Binding Buffer :50mmol/L 乙酸钠（pH = 4. 0)。乙酸钠 2. 051g 溶于 去离子水中，HCl调节pH值至4. 0