一种epo突变体的毛细管电泳检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学分析和药物分析领域，具体地说，涉及一种毛细管电泳方法用于 测定达依泊汀α精细结构，即确定构成达依泊汀α糖组分的种类和含量。
【背景技术】
[0002] 促红细胞生成素（EPO)是一种调节红细胞生成的糖蛋白激素，由肾脏细胞分泌。 由于慢性肾衰竭（CRF)发展过程中肾脏组织逐渐被破坏，EPO分泌不足是肾性贫血的主要 原因。自从上世纪80年代重组人促红细胞生成素（rHuEPO)问世以来，就成为肾性贫血的 主要治疗手段，临床上取得良好的治疗效果。但其半衰期相对较短，通常需要每周给药2 - 3次，给患者和医护人员带来不便，甚至有些患者因为恐惧注射而放弃治疗。
[0003] 达依泊汀a (darbepoetin alfa)是rHuEPO高糖基化的类似物，是通过重组DNA 技术在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞内合成的（参见CN94109128. 7)，已由美国Amgen公司开 发上市，商品名Aranesp。达依泊汀α由5个N连接的糖基侧链及22个唾液酸残基组成， 比rHuEPO多2个N连接糖基侧链和8个唾液酸残基（图1)。rHuEPO是一种单链的酸性糖 蛋白，含有165个氨基酸。EPO的糖基化修饰包括3个N末端糖链（分别位于天冬氨酸残基 Asp24、Asp38和Asp83)和1个丝氨酸氧末端糖链（位于Serl26)，其主要成分是甘露糖、岩 藻糖和唾液酸等。而达依泊汀α通过定点突变的方式，改变了 rHuEPO原有的5个氨基酸 位点（Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn 和 Pro90Thr)，在第 30 和第 88 位氨基酸位 置引入了两个新的N-糖基化位点，但新位点的产生并不影响蛋白质3级结构和其与受体的 结合。达依泊汀α的分子量为37KD，比rHuEPO (30. 4KD)大，其糖基含量也由40 %增加到 52%。由于唾液酸残基带负电荷，因此本品所带负电荷比rHuEPO多。
[0004] 达依泊汀α的生物作用机制与rHuEPO和天然EPO相似，与前体红细胞膜上的EPO 受体结合，启动细胞内信号转导系统，促使前体红细胞增殖、分化、生存期延长，从而使循环 中的红细胞数量和容量增加。静脉注射达依泊汀α的半衰期是rHuEPO的3倍（分别为 25. 3和8. 5小时），清除率显著低于rHuEPO
[0005] 达依泊汀α的糖基化状况直接影响其生物活性。糖蛋白中的寡糖存在微不均一 性，达依泊汀α的质量控制关键在于寡糖分析。由于达依泊汀α所含的唾液酸较易脱 落，而唾液酸能降低达依泊汀α在体内的代谢速度，因此需要能密切控制唾液酸组分即 糖组分的分析方法。
[0006] 理论上达依泊汀α具有22个唾液酸残基，但是由于达依泊汀α所含的唾液酸较 易脱落，因此实际上在通过细胞表达得到的达依泊汀α是糖组分存在微不均一性的混合 蛋白，在质量控制中一般需要控制具有18-22个唾液酸残基的达依泊汀α达到总组分的 80%以上。
[0007] 等电聚焦法是分析达依泊汀α糖组成成份的一种常用分离分析方法，这也是中 国药典规定的分析EPO的方法。但是用等电聚焦法只能做到定性分析，无法做到定量分析。
[0008] 清华大学周国华等利用毛细管电泳技术测定rHuEPO的唾液酸微多相性。毛细管 电泳分离是基于分子的体积/电荷比，其分离效率高于高效液相色谱。rHuEPO的糖基是唾 液酸化的，并且唾液酸化的程度差异较大，例如N-连接糖链可能带四个唾液酸，也可能 带三个、两个或一个唾液酸。rHuEPO的等电点在4.0左右，当介质的p H值大于等电点 后，唾液酸带负电，故可根据唾液酸的多少，通过电泳加以分离。毛细管电泳将rHuEPO 分离成7个峰，这是由糖蛋白的唾液酸微多相性引起的，而在体积排阻H P L C中仅有一 个rHuEPO峰，因唾液酸与rHuEPO的体内活性有关，所以毛细管电泳比H P L C更能反映 rHuEPO的纯度微多相性及生物学活性。
[0009]目前还没有毛细管电泳技术测定达依泊汀α糖组成成份的报道。由于达依泊汀 α的等电点在3. 3左右，分离该酸性蛋白需要在较低的pH条件下进行，而这种低pH环境对 于酸性蛋白的分离有较大负面影响，采用清华大学周国华等报道的毛细管电泳条件分离达 依泊汀α无法取得良好的分离效果。本申请发明人经过多次摸索，建立了具有良好分离效 果的达依泊汀α毛细管电泳技术，实现完全的基线分离。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的在于提供一种新的基于毛细管电泳技术的达依泊汀α精细结 构的分析方法，可用于达依泊汀α药物生产过程的质量控制。
[0011] 本发明涉及的毛细管电泳方法包括以下步骤：
[0012] (1)、通过毛细管电泳对含有达依泊汀α的样品进行分离；
[0013] (2)、根据色谱峰面积对具有不同糖组分达依泊汀α进行定量测定。
[0014] 本发明所使用石英毛细管总长范围在70~200cm之间（柱有效长度为柱总长减 去10cm),柱内径可以用25~75 μ m。优选石英毛细管内径40~60 μ m，总长90~140cm ;
[0015] 本发明所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3. 3-5. 5 的任一种缓冲液、I-IOmM的腐胺和1-9M的尿素。发明人意外发现，在缓冲液中加入腐胺和 尿素能够影响达依泊汀α在毛细管电泳过程中的迁移速度，从而可以提高不同糖组分的 达依泊汀α的分离度。
[0016] 优选的，所使用的缓冲溶液可选自醋酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH范围为3. 6~ 4. 5,缓冲溶液中可加入I-IOmM腐胺和1-9M尿素。更优选的，所述的缓冲溶液包含1~ IOOmM氯化钠，1~IOOmM甘氨酸，1~IOOmM乙酸钠，4~9M尿素，I-IOmM腐胺，pH范围为 3. 6~4. 5。更优选的，所述的缓冲溶液包括5~20mM氯化钠，5~20mM甘氨酸，5-20mM乙 酸钠，5~8M尿素，2-5mM腐胺，pH范围为3. 6~4. 5。
[0017] 本发明毛细管电泳的电极电压为10~50kv，优选可为20~40KV。
[0018] 本发明所述方法的毛细管电泳采用压力进样，压力范围为30~60mbar，时间范围 为5~30s。优选进样压力范围为40~50mbar，时间范围为10~20s ;
[0019] 本发明所使用的柱温范围为10~40°C，优选为25~35°C ;
[0020] 本发明所使用检测波长为紫外210-232nm，优选为214nm。
[0021] 作为优选，毛细管电泳分离的条件范围为：
[0022] 本发明所使用石英毛细管总长范围在70~200cm之间，柱内径可以用25~ 75 μ m ;所用的毛细管电泳缓冲液包括能维持在水溶液状态下pH范围为3. 3-5. 5的任一种 缓冲液、I-IOmM的腐胺和1-9M的尿素；毛细管电泳的电极电压为10~50kv ;电泳时采用压 力进样，压力范围为30~60mbar，时间范围为5~30s ;柱温范围为10~40°C，检测波长 为紫外 210-232nm ;
[0023] 更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
[0024] 本发明所使用石英毛细管总长范围在90~140cm之间，柱内径可以用40~ 60 μ m ;毛细管电泳缓冲溶液可选自醋酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH范围为3. 6~4. 5,缓冲溶 液中可加入I-IOmM腐胺和1-9M尿素；毛细管电泳的电极电压为10~50kv ;电泳时采用压 力进样，压力范围为30~60mbar，时间范围为5~30s ;柱温范围为10~40°C，检测波长 为紫外 210-232nm ;
[0025] 更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
[0026] 本发明所使用石英毛细管总长范围在90~140cm之间，柱内径可以用40~ 60 μ m ;毛细管电泳缓冲溶液包含1~IOOmM氯化钠，1~IOOmM甘氨酸，1~IOOmM乙酸钠， 4~9M尿素，I-IOmM腐胺，pH范围为3. 6~4. 5 ;毛细管电泳的电极电压为20~40kv ;电泳 时采用压力进样，压力范围为40~50mbar，时间范围为10~20s ;柱温范围为25~35°C， 检测波长为紫外214nm。
[0027] 更优选的，本发明的毛细管电泳分离的条件范围为：
[0028] 本发明所使用石英毛细管总长范围在90~140cm之间，柱内径可以用40~ 60 μ m ;毛细管电泳缓冲溶液包括5~20mM氯化钠，5~20mM甘氨酸，5-20mM乙酸钠，5~ 8M尿素，2-5mM腐胺，pH范围为3. 6~4. 5 ;毛细管电泳的电极电压为20~40kv ;电泳时采 用压力进样，压力范