酸溶液当中，此时溶液慢慢变为桃红色。继续加入煮沸，保持沸腾状态5-10min。而后停止加热，冷却直至室温，最后停止搅拌。所得到的金胶放于棕色广口瓶中4摄氏度保存。
[0037](2)金纳米粒子-ATP适体的制备
[0038]取所制金胶500 μ L。取100 μ L浓度为liTmol/L的DNA2溶液加入至所取的金胶缓冲溶液当中，混合均匀。在室温条件下摇床避光12h，之后再静置12h。
[0039]二、硅基介孔材料的制备
[0040](I) S1-MP 的制备
[0041]将3.5ml2mol/L的NaOH加入到500mlCTAB(lg)的水溶液中，搅拌15min后，在室温下加入5mlTE0S，恒温80°C下大力搅拌2h。反应结束后将白色固体滤出，用甲醇洗净，在真空环境下干燥24h。
[0042](2) S1-MP-NH2 的制备
[0043]S1-MP溶于适量甲苯溶液中，混合均匀后，加入8ml3_氨丙基三甲氧基硅烷，在80°C恒温下搅拌2h。反应结束后滤出固体产品，用甲醇洗净，在烘箱中烘干。
[0044](3) S1-MP-CHO 的制备
[0045]取0.2gS1-MP-NH2均匀地溶于5%戊二醛溶液300mL中，常温下搅拌lh。反应结束后将固体颗粒离心分离后再用去离子水洗涤三次，得到产品后在烘箱中将产品干燥。
[0046]三、材料性能的检测
[0047](I) S1-MP-CHO与荧光素的结合
[0048]取0.02gS1-MP-CH0均匀地溶于ImlPBS缓冲溶液当中，取500 μ L所得溶液，加入200 μ L浓度为10_4mol/L的荧光素，混合均匀，在室温下，置于暗处24h。
[0049](2) S1-MP-CHO 与 DNAl 的结合
[0050]取100 μ L的浓度为KTmol/L的DNAl溶液与⑴中溶液混合，在室温条件下摇床12h，之后再在暗处静置12h。
[0051](3)介孔材料与金胶结合
[0052]将两种溶液混合均匀，室温下静置2h。离心，去除上清液，得到固体产品。用PBS缓冲溶液多次洗涤得到固体产物。
[0053]四、荧光检测
[0054]采用逐级稀释法配制不同浓度的ATP溶液，向ATP溶液加入一份固体，另一份加入无ATP的PBS缓冲溶液以此作为空白对照，于37°C水浴恒温lh。将所得产品离心，取出上清液，测荧光，得到数据。
[0055]五、在细胞中活体检测
[0056]样品封堵之后取一定量的MCF-7癌细胞与其混合，在荡床中放置1.5h，用激光共聚焦测试样品。
【主权项】
1.生物纳米容器的制备及其在癌症治疗中的应用。步骤包括: (a)修饰有ATP适体的金纳米粒子的合成:首先制备还原性的金胶粒子，将ATP适体DNA2加入到金胶缓冲溶液中混合均匀，在室温条件下摇床避光12h，再静置12h。 (b)S1-MP的合成:将3.5ml2mol/L的NaOH加入到500ml CTAB (Ig)的水溶液中，搅拌15min后，在室温下加入5mlTE0S，恒温80°C下大力搅拌2h。反应结束后将白色固体滤出，用甲醇洗净，在真空环境下干燥24h。 (c)S1-MP-NH2的合成=S1-MP溶于适量甲苯溶液中，混合均匀后，加入8ml3-氨丙基三甲氧基硅烷，恒温80°C搅拌2h。反应结束后滤出固体产品，用乙醇洗净，在烘箱中烘干。 (d)S1-MP-CHO的合成:取0.2gS1-MP-NH2均匀地溶于5%戊二醛溶液300mL中，常温下搅拌lh。反应结束后将固体颗粒离心分离后再用去离子水洗涤三次，得到产品后在烘箱中将产品干燥。 (e)S1-MP-CHO与荧光素的结合:取0.02gS1-MP_CH0均匀地溶于ImlPBS缓冲溶液中，取500 μ L所得溶液,加入200 μ L浓度为10_4mol/L的突光素混合均匀,在室温下,置于暗处24h。 (f)S1-MP-CHO与DNAl的结合:取100 μ L的浓度为l(T7mol/L的DNAl溶液与步骤e中溶液混合，在室温条件下摇床12h，之后再在暗处静置12h。 (g)将a和f两步骤当中所得到的两种溶液混合，室温下静置2h。离心，去除上清液，得到固体产品。用PBS洗涤多次得固体产品。 (h)采用逐级稀释法配制不同浓度的ATP溶液，向ATP溶液加入一份固体，另一份加入无ATP的PBS缓冲溶液以此作为空白对照，于37°C水浴恒温lh。 (i)将所得产品离心，取出上清液，测荧光，得到数据。 (j)材料在细胞中的检测，样品封堵之后取一定量的MCF-7癌细胞与其混合，在荡床中放置1.5h，用激光共聚焦测试样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中还原性金纳米粒子的制备还原剂可采用柠檬酸三钠等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(b)中所得固体用甲醇清洗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(c)中在制备S1-MP-NH2时，加入3-氨丙基二甲氧基娃烧。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(c)中在制备S1-MP-NH2时，加入3_氛丙基二甲氧基娃烧后要在80°C恒温下反应2h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(d)中在制备S1-MP-CHO时，加入戊二醒后反应lh。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(g)中利用金胶和DNA来封闭硅基介孔材料。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(h)中，ATP的作用是打开DNA双链。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(j)中，使用荧光共聚焦看样品成像。
【专利摘要】本文发明了一种利用高灵敏度的Si纳米结构释放荧光素分子检测ATP的生物纳米容器，并在癌症治疗中应用。金纳米粒子通过Au-S键与ATP分子的适体结合；在醛基修饰的纳米容器(Si-MP-CHO)表面通过共价结合作用，将适体的互补链结合到纳米容器的表面。通过DNA杂交，金纳米粒子将荧光素分子封闭在纳米容器内部。加入ATP，适体与ATP分子特异性结合，使封闭在纳米容器中的金纳米粒子离开其表面，释放出荧光素分子。通过检测荧光信号，来实现对ATP的定量分析。
【IPC分类】G01N33-52
【公开号】CN104764876
【申请号】CN201410329275
【发明人】丁彩凤, 张伟, 李小倩, 陈瑶瑶, 王威, 张书圣
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年7月11日