一种电化学发光纸芯片的制备及其在硫化氢检测中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及低成本、简单、便携式的硫化氢分析检测技术领域，更具体的说是一种电化学发光中空通道纸芯片分析器件的构建。
【背景技术】
[0002]随着经济文化的快速发展，人民生活水平得到明显提高，人们对自身健康问题投入的经费也越来越高。癌症，作为五大绝症之一，直接威胁着人类健康，因此，癌症的早期诊断和治疗成为当今科研工作者的重要研宄课题之一。目前，癌症临床诊断的途径主要有两种，一种是通过医院的大型仪器设备进行初步诊断，这种方法准确度高，但是费时，费力且费用昂贵；另一种便是通过简单的小型掌上设备，实现现场快速分析诊断。
[0003]微流控纸芯片实验室，将样品的制备、分离、检测集成为一体，具有操作简单，携带方便，响应快速的特点，得到了广大科研工作者的认可。目前，微流控纸芯片实验室主要是靠纸纤维的毛细管拉力推动液体的流动，但是样品在这种通道内流动缓慢，耗时长，且样品挥发严重。为了解决这个问题，具有中空通道的微流控纸芯片实验室应运而生。中空通道使得样品在通道内流动快速，增加了样品的储备量，减少了样品的挥发，提高了检测的灵敏度及准确度。但是由于纸纤维导电性不佳，微流控纸芯片实验室响应信号较差，限制了它的进一步应用。
[0004]贵金属纳米粒子和石墨稀的复合纳米材料，因其比表面积大、生物相容性及导电性好，催化性能高等优点备受科研工作者的关注。生长有这种复合纳米粒子的纸芯片，提高了纸纤维的导电性，增加了纸纤维的比表面积，因而广泛应用于各种类型的生物传感器中。
[0005]H2S,是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体，在血清中的含量为10-100微摩尔每升。它是继NO和CO后第三种内生气体信号分子，与很多的病理过程息息相关。因此，发展及研制H2S超灵敏、高选择性的检测技术成为科研工作者奋斗的目标。目前，H2S的检测技术，主要包括以下几种:比色、气相色谱及荧光光谱的方法。这些检测方法灵敏度高，线性范围宽，但是不适合于临床在线检测。因此，寻找一种能够对H2S进行定量分析、操作简单、携带方便、响应灵敏的微流控纸芯片成为当前该研宄领域急需解决的问题之一。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种生长有贵金属纳米粒子的合金和石墨稀复合纳米材料的中空通道微流控纸芯片，通过电化学发光的方法，实现癌细胞内H2S的快速、灵敏检测。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的中空通道电化学发光纸芯片来实现的，该中空通道电化学发光纸芯片的制备方法为:
(1)在计算机上设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案(附图1);
(2)通过蜡打印机将步骤(I)中设计的纸芯片打印上疏水图案；
(3)将步骤(2)中得到的纸芯片于60-150°C下加热1-2分钟，使蜡融化，形成疏水层；
(4)将步骤(3)中得到的纸芯片放于激光切割机上，将中间纸芯片上亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；
(5)在计算机上设计与步骤(I)中设定的疏水蜡打印图案相互匹配的三电极，包括工作电极，参比电极以及对电极；
(6)采用丝网印刷技术，将步骤(4)所制备的纸芯片上印上三电极(附图2);
(7)在工作电极上生长三维石墨烯和AuOPd合金纳米粒子(3D-GN-Au@Pd-PWE)，实现工作电极的功能化；
(8)将石墨烯量子点(GQDs)，适配体链及癌细胞固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白(BSA)封锁活性位点；
(9)在步骤(8)所得的纸芯片前处理区埋伏上储备液；
(10)将步骤(9)所得的纸芯片折叠(附图3)，滴加电解质溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，准备样品的测定。
[0008]本发明所设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案所用的软件为Adobeillustrator CS4，蜡打印图案包括三个颜色区域，白色区域，灰色区域和黑色区域，白色区域四分色所占比例均为0%;灰色区域四分色所占比例依次为:蓝绿色0%，洋红色0%，黄色50-60%，黑色0% ;黑色区域四分色所占比例依次为:蓝绿色0%，洋红色0%，黄色0%，黑色
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[0009]本发明所设计的中空通道纸芯片的具体尺寸如附图2所示，工作电极所在亲水区域直径为6 _，四个工作电极间的疏水区域为半疏水区亦即正面为疏水区，反面为亲水区，四个工作电极两两间距为15 mm，与四个工作电极间椭圆形的区域相对应的反面亲水区域为样品前处理区，椭圆长轴直径为3.5 _，短轴直径为2 _，中空通道宽为2 _，中空通道的直径与左侧纸芯片完全一致，右侧纸芯片为参比电极和对电极所在区域，直径为8 mm,中间区域为2 _的孔洞，用于滴加电解质溶液。
[0010]本发明所用的蜡打印机为富士施乐喷蜡打印机。
[0011]本发明所用的纸芯片为普通滤纸或者色谱纸。
[0012]本发明所述的丝网印刷技术印刷的工作电极为碳印刷电极，对电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
[0013]本发明所述的在工作电极上生长三维石墨稀和AuOPd合金纳米粒子以实现纸芯片功能化的步骤为:
制备生长有Au纳米粒子种子的工作电极:首先先制备Au纳米粒子的种子:量取80 mL去离子水于三口烧瓶中，加热至96 ° C并保持I min，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15 min,自然冷却到室温即可；取15 μ?的所得到的Au纳米粒子，滴加到裸露的纸芯片的工作区域，室温下干燥I h即可；
制备三维氧化石墨稀:0.75 g石墨粉加入到100 mL H2S04/H3P04 (体积比为9:1)混合溶液中，室温下搅拌，随后加入4.5 g KMnO4加热到50 °C，回流12 h，随后冷却到室温，将混合物加入到300 mL含4 mL H2O2的冰水混合物中，随后离心，去除未反应的石墨，将产物于60 ° C真空干燥，随后将制备的氧化石墨烯溶解在超纯水中，形成0.5 mg.mL—1的单层氧化石墨稀片；
制备3D-GN-Au@Pd-PWE:将生长有Au纳米粒子的纸芯片，放于含有10 mL 0.5 mg ?πιΓ1氧化石墨烯，100 mM HAuCl4,100 mM H2PdCl4, 20 PL的聚乙二醇的混合溶液中，超声I h，随后将混合溶液放于高压釜中，190 °C下加热8-10 h，最后将纸芯片取出，冰冻干燥即可；
本发明所述的将石墨烯量子点(GQDs)，适配体链及癌细胞固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点的步骤为:
制备GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，使用电热套加热到200 ° C，溶液颜色将由无色，转变为浅黄色，再转变为橙色，继续加热30 min即可得到GQDs ;
固定GQDs、适配体链(Apt)及癌细胞:将10 yL GQDs，10 μ L Apt, 10 yL不同浓度的MCF-7癌细胞依次固定在经GQDs和3D-GN_Au@Pd修饰过的纸芯片工作电极上，得到MCF-7-Apt-GQDs-3D-GN-Au@Pd-PWE，最后加入 10 μ L BSA 以封锁活性位点；
本发明所述的纸芯片样品前处理区储备溶液为MCF-7癌细胞的相应刺激物也就是血管内皮细胞生长因子，或者空白储备区，具体的步骤为:
将10 PL癌细胞的相应刺激物也就是血管内皮细胞生长因子提前滴加到样品前处理区，干燥，完成电化学发光强度与癌细胞浓度关系的测定；将前处理区变为空白前处理区，电解质溶液中外加不同浓度的Na2S，测定硫化钠浓度与电化学发光强度关系；
电解质溶液为含有0.01-1 M K2S2O8,0.1-10 μΜ Cu2+的0.1M的PBS缓冲溶液。
[0014]本发明的有益效果
(1)中空通道纸芯片的采用，提高了样品液体流动速度，减少了样品的挥发，提高了检测的灵敏度；
(2)3D-GN-AuiPd-PWE的使用，提高了纸芯片的导电性及比表面积，使信号强度获得大幅度提尚;
(3)通过将电化学发光与纸芯片联用，实现了癌细胞内信号分子，亦即H2S的灵敏检测。
【附图说明】
[0015]图1:中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案；
图2:疏水蜡打印图案上丝网印刷上4个工作电极，用数字I表示，4个参比电极，用数字2表示及4个对电极，用数字3表示后的图，其中，左侧纸芯片上为4个工作电极；右侧纸芯片上为4个参比电极，4个为对电极；中间纸芯片为中空通道所在区；
图3:中空通道纸芯片的折叠方式。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
一种电化学发光中空通道纸芯片的制备及其在癌细胞硫化氢检测中的应用:
(1)在计算机上设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案，工作电极所在亲水区域直径为6 _，四个工作电极间的疏水区域为半疏水区亦即正面为疏水区，反面为亲水区，四个工作电极两两间距为15 _，与四个工作电极间椭圆形的区域相对应的反面亲水区域为样品前处理区，椭圆长轴直径为3.5 mm，短轴直径为2 mm，中空通道的直径与左侧纸芯片完全一致，右侧纸芯片为参比电极和对电极所在区域，直径为8 mm，中间区域为2 mm的孔洞；
(2)通过富士施乐喷蜡打印机将步骤(I)中设计的滤纸纸芯片打印上疏水图案；
(3)将步骤(2)中得到的纸芯片于60-150°C下加热1-2分钟，使蜡融化，形成疏水层；
(4)将步骤(3)中得到的纸芯片放于激光切割机上，将中间纸芯片上亲