水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道；
(5)在计算机上设计与步骤(I)中设定的疏水蜡打印图案相互匹配的三电极，包括工作电极，参比电极以及对电极；
(6)采用丝网印刷技术，将步骤(4)所制备的纸芯片上印上三电极；
(7)在步骤(6)所得的工作电极上生长3D-GN-Au@Pd-PWE，实现工作电极的功能化，亦即制备生长有Au纳米粒子种子的纸芯片工作电极:首先先制备Au纳米粒子的种子:量取80 mL去离子水于三口烧瓶中，加热至96 ° C并保持I min，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15 min,自然冷却到室温即可；取15 μ?的所得到的Au纳米粒子，滴加到裸露的纸芯片的工作区域，室温下干燥I h即可；
制备三维氧化石墨稀:0.75 g石墨粉加入到100 mL H2S04/H3P04 (体积比为9:1)混合溶液中，室温下搅拌，随后加入4.5 g KMnO4加热到50 °C，回流12 h，随后冷却到室温，将混合物加入到300 mL含4 mL H2O2的冰水混合物中，随后离心，去除未反应的石墨，将产物于60 ° C真空干燥，随后将制备的氧化石墨烯溶解在超纯水中，形成0.5 mg.mL—1的单层氧化石墨稀片；
制备3D-GN-Au@Pd-PWE:将生长有Au纳米粒子的纸芯片，放于含有10 mL 0.5 mg ?πιΓ1氧化石墨烯，100 mM HAuCl4,100 mM H2PdCl4, 20 PL的聚乙二醇的混合溶液中，超声I h，随后将混合溶液放于高压釜中，190 °C下加热8-10 h，最后将纸芯片取出，冰冻干燥即可；
(8)将GQDs，适配体链及癌细胞固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点，亦即制备GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，使用电热套加热到200 °C，溶液颜色将由无色，转变为浅黄色，再转变为橙色，继续加热30 min即可得到GQDs ;
固定GQDs、Apt及癌细胞:将10 yL GQDs, 10 μ L Apt及10 yL不同浓度的MCF-7癌细胞依次固定在经GQDs和3D-GN_Au@Pd修饰过的纸芯片工作电极上，得到MCF-7-Apt-GQDs-3D-GN-Au@Pd-PWE，最后加入 10 μ L BSA 以封锁活性位点；
(9)在步骤(8)所得的纸芯片上前处理区埋伏上储备液，即将10PL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子提前滴加到样品前处理区，干燥；
(10)将步骤(9)所得的纸芯片折叠(附图3)，滴加含有20μ? 0.01-1 M K2S2O8,0.1-10μΜ Cu2+的0.1 M的PBS缓冲溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，准备样品的测定，绘制电化学发光强度与癌细胞浓度的标准曲线；而后固定其它条件不变，仅改变电解质溶液和前处理区所加样品，即前处理区为空白前处理区，电解质溶液为外加不同浓度的Na2S后的电解质溶液，绘制电化学发光强度与Na2S浓度的标准曲线；通过比较两个标准曲线，实现MCF-7内H2S的检测。
[0017]实施例2
制备步骤同例1，不同之处是:所用纸芯片为色谱纸。
【主权项】
1.一种电化学发光纸芯片的制备及其在硫化氢检测中的应用，其特征是包括以下步骤: 1.1在计算机上设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案； 1.2通过蜡打印机将步骤1.1中设计的纸芯片打印上疏水图案； 1.3将步骤1.2中得到的纸芯片于60-150 °C下加热1_2分钟，使蜡融化，形成疏水层；1.4将步骤1.3中得到的纸芯片放于激光切割机上，将中间纸芯片上亲水区域切掉，形成样品液体流动的中空通道； 1.5在计算机上设计与步骤1.1中设定的疏水蜡打印图案相互匹配的三电极，包括工作电极，参比电极以及对电极； 1.6采用丝网印刷技术，将步骤1.4所制备的纸芯片上印上三电极； 1.7在工作电极上生长三维石墨烯和AuOPd合金纳米粒子(3D-GN-AuiPd-PWE),实现工作电极的功能化； 1.8将石墨稀量子点(GQDs)，适配体链(Apt)及癌细胞固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白(BSA)封锁活性位点； 1.9在步骤1.8所得的纸芯片前处理区埋伏上储备液； 1.10将步骤1.9所得的纸芯片折叠，滴加电解质溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，准备样品的测定。
2.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，所设计中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案所用的软件为Adobe illustrator CS4，蜡打印图案包括三个颜色区域，白色区域，灰色区域和黑色区域，白色区域四分色所占比例均为0%;灰色区域四分色所占比例依次为:蓝绿色0%，洋红色0%，黄色50-60%，黑色0% ;黑色区域四分色所占比例依次为:蓝绿色0%，洋红色0%，黄色0%，黑色100%。
3.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，中空通道纸芯片的疏水蜡打印图案的工作电极所在亲水区域直径为6 mm,四个工作电极间的疏水区域为半疏水区亦即正面为疏水区，反面为亲水区，四个工作电极两两间距为15 mm，与四个工作电极间椭圆形的区域相对应的反面亲水区域为样品前处理区，椭圆长轴直径为3.5 _，短轴直径为2 mm,中空通道的直径与左侧纸芯片完全一致，右侧纸芯片为参比电极和对电极所在区域，直径为8 mm，中间区域为2 mm的孔洞。
4.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，所用的喷蜡打印机是富士施乐喷蜡打印机；所用的纸芯片为普通滤纸或者色谱纸。
5.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，所述的丝网印刷技术印刷的工作电极为碳印刷电极，对电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
6.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，工作电极上生长3D-GN-Au@Pd-PWE，实现工作电极功能化的具体工艺如下: 首先先合成Au纳米粒子的种子:量取80 mL去离子水于三口烧瓶中，加热至96 °(:并保持I min，之后加入2.8 mL 1%柠檬酸钠，继续搅拌15 min，自然冷却到室温即可；取15μ?的所得到的Au纳米粒子，滴加到裸露的纸芯片的工作区域，室温下干燥I h即可； 合成三维氧化石墨稀:0.75 g石墨粉加入到100 mL H2S04/H3P04 (体积比为9:1)混合溶液中，室温下搅拌，随后加入4.5 g KMnO4加热到50 °C，回流12 h，随后冷却到室温，将混合物加入到300 mL含4 mL H2O2的冰水混合物中，随后离心，去除未反应的石墨，将产物于60 ° C真空干燥，随后将合成的三维氧化石墨烯溶解在超纯水中，形成0.5 mg.mL—1的单层三维氧化石墨烯片； 合成3D-GN-Au@Pd-PWE:将生长有Au纳米粒子的纸芯片，放于含有10 mL 0.5 mg ?πιΓ1三维氧化石墨烯，100 mM HAuCl4,100 mM H2PdCl4, 20 PL的聚乙二醇的混合溶液中，超声Ih，随后将混合溶液放于高压釜中，190 °C下加热8-10 h，最后将纸芯片取出，冰冻干燥即可。
7.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，所述的将GQDs，适配体链及癌细胞固定在亲水区域，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点，具体制备工艺如下: 首先合成GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，使用电热套加热到200 °C，溶液颜色将由无色，转变为浅黄色，再转变为橙色，继续加热30 min即可得到GQDs ; 固定GQDs、Apt及癌细胞:将10 yL GQDs, 10 μ L Apt及10 yL不同浓度的MCF-7癌细胞依次固定在经GQDs和3D-GN_Au@Pd修饰过的纸芯片工作电极上，得到MCF-7-Apt-GQDs-3D-GN-Au@Pd-PWE，最后加入 10 μ L BSA 以封锁活性位点。
8.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，纸芯片上前处理区埋伏的储备液为10 PL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子。
9.根据权利要求书I所述一种电化学发光纸芯片的制备，其特征在于，样品的测定步骤，滴加含有20 μ? 0.01-1 M K2S2O8,0.1-10 μΜ Cu2+的0.1M的PBS缓冲溶液，并将纸芯片与电化学工作站相连，准备样品的测定，绘制电化学发光强度与癌细胞浓度的标准曲线；而后固定其它条件不变，仅改变电解质溶液和前处理区所加样品，即前处理区为空白前处理区，电解质溶液为外加不同浓度的Na2S后的电解质溶液，绘制电化学发光强度与Na2S浓度的标准曲线；通过比较两个标准曲线，实现MCF-7内H2S的检测。
【专利摘要】本发明公开了一种电化学发光纸芯片的制备方法及所述的电化学发光传感器测定MCF-7中信号分子硫化氢含量的方法。利用蜡打印技术在纸上制备疏水区域、半疏水区、亲水区域以及中空通道，通过激光切割机切割中空通道，配置合适的油墨，在纸上印制相应的参比电极和工作电极，再对工作区域进行功能化以及前处理区储备液的滴加，进而癌细胞的固定；将制备好的纸芯片进行折叠，构成三电极体系，在反应区域滴加电解质溶液，连接电化学工作站，实现了癌细胞中低含量的信号分子的高灵敏检测。
【IPC分类】G01N21-76
【公开号】CN104819976
【申请号】CN201510245913
【发明人】于京华, 李丽, 颜梅, 葛慎光, 刘海云, 张彦, 苏敏, 刘芳, 梁琳琳
【申请人】济南大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月15日