一种基于原位形成光活性纳米材料模拟酶的碱性磷酸酯酶活性检测方法
【专利说明】
活性检测方法技术领域:
[0001]本发明涉及纳米科技领域和生物分析检测领域，尤其涉及新型的光活性纳米材料模拟酶及其在碱性磷酸酯酶活性检测中的应用。
【背景技术】
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[0002]碱性磷酸酯酶(ALP)是广泛存在于各种生物组织中的一种酶。ALP的存在浓度与骨骼疾病、肝炎以及前列腺癌等多种疾病的发生密切相关[Colombatto P.；Randone A.；Civitico G.；Gorin J.M.；Dolci L ；Medaina N.；01iveri F.；Verme G.；Marchiaro G.；Pagni R.；Karayiannis P.；Thomas H.C.；Hess G.；Bonino F.；Brunetto M.R.J.ViralHepatitis 1996，3，301-306]。此外，ALP具有催化活性高，稳定性好，成本低，广泛的底物特异性等优点，是一种被广泛使用的免疫分析标记物，被用于酶联免疫测定中[LeiJ.；Ju H.Chem.Soc.Rev.2012，41，2122-2134 ;Akanda M.R.；Tamilavan V.；Park S.；Jo K.；Hyun Μ.H.;Yang H.Anal.Chem.2013, 85, 1631-1636 ；Xian Y.L.；Wang Z.； JiangX.Y.ACS Nano 2014，8，12741 - 12747 ；Geraud E.；Prevot V.；Forano C.；Mousty C.Chem.Commun.2008, 13，1554 - 1556]。在酶联免疫测定中，抗原与抗体之间可以产生特异性的结合，通过标记在抗体上的ALP的催化反应产生测量信号。因为单个酶分子可以催化许多个底物分子产生大量的产物，从而使检测信号放大[Zhang B.；Tang D.；Goryacheva 1.；Niessner R.；Knopp D.Chem.-Eur.J.2013，19，2496-2503]。目前，以天然酶为标记物的酶联免疫吸附分析在环境检测、食品安全及临床诊断等方面已经成长为重要的技术之一 [Quff.；LiuY.；Liu D.；ffang Z.Jiang X.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3442-3445]。因此，ALP活性的检测在临床疾病诊断以及免疫分析研宄中具有重要意义。
[0003]目前，大部分针对ALP的检测方法虽然较为简单，但是，由于这类方法单纯依靠ALP催化产生的产物的电化学信号或光信号进行检测，缺少信号放大策略，方法的灵敏度不是很高[Gao Z.；Xu M.；Hou L.；Chen G.；Tang D.Anal.Chem.2013, 85, 6945 - 6952 ；ZhangL.；Zhao J.；Duan M.；Zhang H.；Jiang J.；Yu R.Anal.Chem.2013，85，3797-3801 ；Wei H.；Chen C.；Han B.；Wang E.Anal.Chem.2008，80，7051 - 7055 ;Qian Z.；Chai L ;Tang C.；Huang Y.；Chen J.；Feng H.Anal.Chem.2015，87，2966-2973]。所以，探索高效的信号放大策略以建立高灵敏的ALP活性的检测方法仍然是需要解决的问题。
[0004]随着纳米科技的发展，基于纳米材料的分析方法因其具有快速、灵敏的特点以及更加容易微型化等优点引起了大家广泛的关注。纳米材料模拟酶具有高效的模拟酶活性，并且还具有稳定性好，酶活性容易调节等特点[Wei H.;Wang E.Chem.Soc.Rev.2013，42，6060 - 6093 ；Lin Y.H.；Ren J.S.；Qu X.G.，Acc.Chem.Res.2014，47，1097 -1105]。尽管具有过氧化物酶活性的纳米材料具有较好的活性，但缺乏方便的手段控制和触发其类酶活性。另外，此类酶在工作时依赖具有危害性的过氧化氢作为电子受体。这些问题严重限制着过氧化物纳米材料模拟酶的活性、生物相容性及其在生物分析中的应用[TaoY.；Lin Y.H.；Huang Ζ.Ζ.；Ren J.S.；Qu X.G.Adv.Mater.2013，25，2594 - 2599]。目前的纳米材料模拟酶几乎都是采用一定的化学试剂反应制备好后使用。与当前的研宄不同，本发明利用天然酶酶的催化反应原位形成了一种具有较高催化活性的光活性纳米材料模拟酶。碱性磷酸酯酶(ALP)催化磷酸酯类底物如邻苯二酚磷酸酯、水杨酸磷酸酯的水解反应产生的含有双羟基的化合物能够与二氧化钛纳米材料表面的钛(IV)发生特异性的络合反应，在纳米材料表面形成电荷转移络合物。单独的二氧化钛纳米材料并没有表现出光活性模拟酶性质，而结合了双羟基化合物的二氧化钛纳米材料可以在可见光光照条件下产生较高的模拟氧化酶活性。该氧化酶的活性可以通过光照方便的进行调控；在不依靠过氧化氢的存在下，表现出了很高的类酶催化活性，表明其具有更好的稳定性和生物相容性。与大多数纳米材料模拟酶相比，本方法的特点在于此纳米光活性模拟酶通过ALP的原位催化反应产生；与常规的ALP活性检测方法相比(单纯依靠催化反应的产物的电化学/光学信号)，ALP的催化产物原位形成的纳米光活性模拟酶进一步对ALP活性的检测产生了良好的信号放大作用。实现了 ALP活性的高灵敏检测，检测限低至0.01U/L，远低于成人血清中 ALP 的含量 40-190U/L[Hausamen T.U.；Helger R.；Rick ff.；Gross ff.Clin.Chim.Acta1967，15，241-245]。满足实际样品中ALP的检测需求。据我们所知，利用酶催化反应原位形成的光活性纳米材料模拟酶进行酶活性检测，尚无文献报道。该方法在ALP的检测以及以ALP为标记物的免疫分析中具有广阔的应用前景。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种基于光活性纳米材料模拟酶的碱性磷酸酯酶活性检测方法，该光活性纳米材料模拟酶可以通过碱性磷酸酯酶的催化反应原位产生；利用碱性磷酸酯酶催化反应形成的光活性纳米材料模拟酶的高效类酶催化活性实现信号放大，可以方便、灵敏、快速地检测碱性磷酸酯酶活性。
[0006]本发明的目的可通过如下技术措施来实现:
[0007]a、二氧化钛纳米材料的制备:将5mL含钛化合物逐滴加入到75mL超纯水中，混合后的溶液在室温下持续搅拌。然后将上述溶液转移到反应釜内并加热到160°C持续24h。离心获得产物并用超纯水洗涤多次，最后烘干获得白色二氧化钛纳米颗粒；
[0008]b、碱性磷酸酶活性的测定:5 μ mo I/L的碱性磷酸酶的底物与10 μ L不同浓度的碱性磷酸酯酶混合后加入到96微孔板中，室温下反应一段时间；加入10 μ L 1.5mg/mL的二氧化钛纳米材料反应15min后，加入100 μ L pH为4.0的0.2mol/L的醋酸缓冲溶液和20