r>[0050] 本发明还提供一种检验膜蛋白的生物活性的方法，所述方法包括提供本发明的粒 子并且分析在包封粒子的脂质双层内部的膜蛋白的生物活性。
[0051] 生物活性可W如本领域公知那样测试（例如化ie化ich等人，Bio地ysical Journal95,2008:1500-1510)。可W进行化学反应或结合反应，该产生依赖于所述反应的 可检测信号。化学反应包括酶的酶促反应、配体与蛋白质、尤其受体蛋白及任何其他蛋白质 的结合。因此可W筛选潜在抑制化合物或激活化合物。因此，本发明还设及一种分析膜蛋 白结合候选结合物质的能力的方法，所述方法包括提供本发明的粒子，添加候选结合物质 并确定所述候选结合物质和在包封粒子的脂质双层中的膜蛋白的结合事件。其他活性包括 在粒子的脂质膜下方亲水层、优选地含水层中离子浓度的变化，尤其在离子通道的情况下， 所述离子通道可W根据它们的活性调节离子浓度。
[0052] 生物活性可W选自酶促反应、运输分子或离子、优选地通过离子通道运输离子和 配体结合作用。酶促反应是由蛋白质催化的反应，所述蛋白质将一种或多种底物转化成一 种或多种不同于底物的产物。运输设及将某个部分从膜的一侧运输至膜的另一侧。通常， 运输的部分通过该蛋白质并且与之相互作用，特别地在该蛋白质的表面上。表面可W是例 如在通道中的内表面。配体结合作用可W设及或可W不设及天然配体，即根据蛋白质（例 如受体和信号传导分子）的天然功能作为生物系统中蛋白质的结合配偶物的配体。
[0053] 任何该类活性、反应、结合事件或浓度变化可W通过已知手段确定，所述手段包括 巧光或CD光谱法、紫外光谱法、VIS光谱法、NIR或IR透射、静电变化例如膜电位变化、抑变 化、跨膜电位变化。定量分析离子通道的又一个非常重要的参数是形成与离子运输相关、通 过巧光测量、尤其FRET测量可及及特别设计用于高通量筛选的膜电位（进一步参见下文） (Jesiis1999,上文）。例如，采用金属粒子，如Ag粒子或Au粒子，可W使用系统的光学特性 确定离子浓度（例如pH)变化、化合物结合或从膜系统、尤其从膜或膜蛋白解离。
[0054] 优选地，所述候选结合物质是可能修饰所述膜蛋白的生物活性的候选活性物质， 其中确定结合事件的步骤包括确定所述膜蛋白的目的生物活性的步骤。该类生物活性已 经在上文讨论并且包括脂质双层的跨膜电位变化或粒子与脂质双层之间体积的变化（尤 其对于离子通道而言）或催化活性（特别地对于酶而言）的变化和结合事件的变化（例如 对于结合特定配体、尤其天然配体的受体，其中可W因存在候选物竞争性抑制所述受体结 合）。生物活性可W由各种条件触发，如在离子通道，其中活性可W由离子浓度变化触发。 该类生物活性可W由候选化合物调节，例如在较高或较低离子浓度开放/关闭通道。其他 活化模式可W包括光激发、施加跨膜电位或存在底物。
[00巧]本发明还设及一种制备具有脂质双层的粒子的耐用性可复水制品的方法，所述方 法包括提供本发明的粒子并冷冻所述粒子，优选地急骤冷冻（shock-化eezing)所述粒子。 本发明的粒子已经展示的良好稳定性并且可W冷冻W长期储存，例如储存至少2个月、至 少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少8个月、至少10个月或至少12月。在 储存后，粒子可W解冻和/或恢复到任何目的介质、尤其含水介质中。通常，使用的粒子分 散于水质流体中。可W通过至少在解冻期间和/或在标准条件下添加与水可溶混的极性非 水性溶剂，辅助解冻。溶剂可W是疏质子或亲质子的。它可W是分子大小最多1000化、更优 选地最多500化或甚至最多300化的小分子。它可化含有幾基或杂幾基。在又一个实施方 案中，它可W包含C1-C4烷基醇基或它可W是多元醇。在优选的实施方案中，它不是去垢剂， 和/或不包含长度超过Cs的长脂族链。与水混合时，它不应当溶解脂质双层。示例溶剂是 例如DMS0、甘油、DMF、偶氮膳（azonitrile)、己膳、丙酬。
[0056] 本发明在附图和后续实施例中进一步描述，不限于本发明的该些实施方案。
【附图说明】：
[0057] 图1 ;基于NTA修饰琼脂糖珠的蛋白质-脂质头部（PLB)的示意图（具有Cg-NTA 接头的中央球状体），CcO(显示为膜中的螺旋结构）W严格取向借助与亚基I连接的化S 标签固定化。W黄色和红色标记的化hyPC分子插入在蛋白质之间。向脂质相插入不同 的膜结合型巧光标记物；a) 4- (1-巧-(二-正辛基氨基）-6-蒙基]-2-己締基）-1- (3-丙 横酷基）化晚鐵甜菜碱（二-8-ANEPP巧；b)4-(l-巧-(二-正了基）-6-蒙基]-4-了二 締基了横酷基）嗟咐鐵甜菜碱（二-4-AN抓地巧；C) 1，2-双十六碳酷-sn-甘油 酷-3-磯酷-(N-[4-硝基苯-2-曠-1,3-二挫基）己醇胺（NBD-P巧。巧脂质或可选地生物 素脂质错定物可W用来将脂质错定检测基底如微量滴定板，其中使得所述基底变得疏水性 或可选地用链霉亲和素/抗生物素蛋白修饰。
[005引 图2 ;基于CcO的PLB的激光扫描图像，所述PLB用a)NBD阳、b)二-8-A肥PPS和C)二-4-AN抓地S标记；d)在无CcO情况下用二-4-AN抓地S标记的脂质-珠。
[0059] 图3 ;在二-8-ANEPPS标记的基于CcO的PLB的a)赤道面和b)轴处拍摄的激光 扫描图像。
[0060] 图4 ;在第一抗体与CcO亚基I和亚基II特异性结合的基于CcO的PLB的赤道面 拍摄的激光扫描图像。使用切5缀合物第二抗体作为脂质相中a)在二-4-ANBD地S不存在 和b)存在下的巧光标记物。
[0061] 图5 ;分别是在添加细胞色素C至含有抗坏血酸的溶液后，通过A)使用图21中所 示定制设置的巧光光谱法（中间实线旨在引导眼）和B)通过表面等离子体增强巧光光谱 法（SPF巧（藍线）和表面等离子体共振光谱法（SPR巧（黑线）测定的用二-4-AN抓地S标 记并与计量细胞表面连接的PLB的相对巧光强度1/1。或IK的时间依赖性变化。SPRS测量 显示SPR角的相对位移（黑线，从R/RJ. 37增加至1. 65)。在两种测量中，膜电位的生成由 归因于与细胞色素C静电相互作用的向上位移接着向下位移指示。
[00的]图6 ;上波数区（A)和下波数区做中仅RC(藍线）和P巧LM中与be惠合体共重 构的RC(澄线）的稳态光-暗光谱。
[006引图7;弛豫期间特征性谱带化and)的动力学。实屯、圆1434畑巧普带，实屯、方块 1282cm-H普带，实屯、向上S角形1642cnrH普带，实屯、向下S角形1234cnrH普带，实屯、菱形 1360cm-H普带，空屯、圆1507cm-H普带，空屯、方块1685cnrH普带。全部谱带定期弛豫，同时在 1234cm-i的谱带具有不同于其他谱带的弛豫样式。
[0064]图8;上波数区（A)和下波数区做中在添加细胞色素C之前（绿线）和之后（红 线），p巧LM中与bci复合体和额外Q1。共重构的RC的稳态光-暗光谱。在照亮之前在暗处 记录参比图谱（黑线）。
[006引 图9;用二-8-ANEPPS标记的蛋白质-脂质珠（a;3天时间；b;12天时间）。PLB 在约2周后仍然稳定，即使它们总是处于其流动小室中（图b)。
[0066] 图10;在KCl/Kpi(l〇〇/50mM)中具有/没有苯胺/3-駿基-2,2,5,5-四甲基-1-化 咯烷基氧化物/钉络合物情况下用AN抓地S标记的琼脂糖-PLB。比较显示无巧光差异。左： 琼脂糖-PLBPBSAN抓地S巧光通道化33皿激发）；右；琼脂糖-PLBPBS+苯胺/3-CP/Ru AN抓地S巧光通道化33nm激发）。
[0067]图 11;在Tris-HCl/KCl6mM/35mM)中具有 / 没有苯胺 /3-駿基-2, 2, 5, 5-四甲 基-1-化咯烷基氧化物/钉络合物情况下用AN抓地S标记的琼脂糖-PLB，比较显示无巧光 差异。左戒脂糖-PLBAN抓地S巧光通道化33皿激发）；右戒脂糖-PLB+苯胺/3-CP/Ru AN抓地S巧光通道化33nm激发）。
[006引 图12;用AN抓地S标记的琼脂糖-PLBTris-肥1 (5mM)。自7. 5的琼脂糖-PLB(针 对Tris-肥1 5mM透析）用AN抓地S标记。不能在Tris-HCl(5mM)中检测到膜形成。没有包 裹珠的巧光标记膜一一但是相反，巧光信号位于大体积内部（可能归因于小的脂质小泡）。 [006引 图13;a;用二-8-A肥PPS标记的蛋白质-脂质珠（在DMS0存在下急骤冷冻和解 冻后）；b;塌陷的用二-8-ANEPPS标记的蛋白质-脂质珠（在水中急骤冷冻和解冻后）
[0070] 图14;在CcO由细胞色素C活化或可选地光活化钉络合物后电子和质子途径的示 意图。
[0071] 图15 ;具有/没有额外白光暴露时用巧光素（激发488nm)标记的琼脂糖-PLB Tris-HCl/KCU5mM/35mM)，比较显示无显著巧光差异，对照实验在Ru络合物不存情况下的 对照实验。左；琼脂糖-PLB巧光素巧光通道；右；琼脂糖-PLB+白光暴露巧光素巧光通道； [007引图16 ;具有/没有苯胺/3-駿基-2, 2, 5, 5-四甲基-1-化咯烷基氧化物/钉络合 物巧mM/35mM)时用巧光素（激发488nm)标记的琼脂糖-PLBTris-肥l/KCU5mM/35mM)，在 具有/没有额外白光暴露下的比较。左；琼脂糖-PLB+苯胺/3-CP/Ru巧光素巧光通道；右： 琼脂糖-PLB+苯胺/3-CP/RU+白光暴露巧光素巧光通道；比较显示当暴露于白光时巧光信 号下降。下降表示从PLB射出质子（pH下降）
[007引 图17;通过分析Si-NP的尺度分布，在Si-NP上借助Zetasizer评价膜形成（与 CcO和DiPhyPC温育）；使用Si-纳米粒子（25皿)。单独的NTA修饰型Si-NP(红色）， NTA-Si-NPs+CcO(绿色）和透析后的Si-NTA-NPs+CcO和DiWiyPC(藍色）。Si-NP的尺寸随 着而添加CcO或CcO+DiPhyPC增加。
[0074]图18 ;逐步添加CcO至含有40y1 ( =lmg)Ni-NTA-Si-NP的溶液后的尺寸分布， 旨在找到其中Si-NP键合位置被蛋白质饱和的CcO浓度。Si-PLB(Ni-NTA-Si-纳米粒子 Ni-NTA-Si-NP)(直径25nm)，CcO结合随后进行光散射实验（zetasizer)。SI-NP;从顶部 至底部Wy1 计的CcO比例，左至右：40:0 ;40:10 ;40:20 ;40:30 ;40:40 ;40:50 ;40:60 ; 40:70。
[00巧]图19 ;基于NTA-SiNP的PLB的UV-VIS;通过连二亚硫酸盐还原CcO/CcO+Si-NPs/Si-PLB。CcO(溶解）、与Si-NP结合的Cc0(直径约 15nm)和针对PBS(KC1/Kpi0. 1/0. 05M) 透析的Si-NP+CcO+DiPhyPC(Si-PLB)的UV-VIS量值和还原（用连二亚硫酸盐）。在每种情 况下均检测到因添加连二亚硫酸盐所致的从420皿至~445皿和从600皿至~605皿的还 原特异性峰偏移。
[0076] 图20 ;具有/没有苯胺/3-駿基-2, 2, 5, 5-四甲基-1-化咯烷基氧化物/钉络 合物用ANBD地S标记的Si-PLBTris-肥1/KC1 6mM/35mM)，均匀巧光发射表示在低离子强 度时膜形成，添加物的添加未显示差异。左；Si-PLBAN抓地S巧光通道化33nm激发）；右； Si-PLB+苯胺/3-CP/RuAN抓地S巧光通道化33nm激发）。
[0077] 图21 ;订制建立的巧光光谱法测量系统；Andorshamrock谱仪，配备Andor NewtonCCD照相机。Olympus物镜，来自OmegaOptics的二色镜。来自JDSUniphase的 632. 8nmHeNe激光器和来自CoherentInc.的488nm二极管激光器，Hamamatsu脉冲氣灯。 实施例
[007引实施例1 ;材料
[0079]使用来自水纯化系统（ari皿proUV,SartoriusStedimBiotechGmbH,GiHtingen, 德国）的超纯