活性形式渗入PBL中，嵌入界定良好的其脂质组分 可轻易互换的双层脂质膜中。蛋白质的两个侧面均是可及的，尤其外侧面，如通过第一抗体 的特异性结合所示。已经在抗坏血酸和氧存在下用细胞色素C启动酶循环后，通过监测插 入双层脂质膜的电压敏感性巧光染料二-8-ANEPPS和二-4-AN抓地S的强度变化，使用时间 解析LSMW及SPFS展示蛋白质的功能。因此可W将膜W功能活性形式渗入珠并用于配体 结合测定W及功能测定W确定膜蛋白的活性。
[0133] 实施例16 (比较例）；结果一一光合性反应中屯、（RCs)连同bci复合体在平面状Au 层上的共重构
[0134]共固定RC和bci复合体及后续形成蛋白质束缚的双层脂质膜柏BLM)，接着SPR 和EIS。光学厚度和电参数对应于CcO情况下存在的相应数据。得出结论；与bci复合体混 合的单层RC已经在金薄膜上形成，而单一蛋白之间的空隙W脂质双层填充。
[01巧]实施例17 (比较例）；光-暗FTIR光谱
[0136] 记录光-暗光谱并且使用在暗处的相应光谱作为参比，计算吸光光谱。图6中显 示与RC共重构的bci复合体的光谱，与仅RC的相应光谱比较。
[0137] 在be惠合体存在下，在1282、1360、1434cnTi的谱带吸光度几乎未改变，而在 1234、1507、1642畑1-1的谱带和在1685畑1-1的负谱带明显地减少。与单一RC相比，在3400cm-i 和3629cnTi的宽负谱带和宽正谱带也显示更小的吸光度。在1685cnTi的负谱带解释了特 定偶P的下降，而在1642cnTi的谱带是酷胺I谱带与水的H-0-H伸缩振动的混合体。在 1234cm-i的谱带是一个突出谱带，处于駿酸的C-0伸缩振动区域（S化art,B.Biological ApplicationsofInfraredSpectroscopy;JohnWiley&Sons,Ltd, 1997)并且因此可W归 因于蛋白质内部任何COOH基团的质子化。在1282、1360、1434cm-i的谱带已经分别归属于 特定偶的巧巾类、一种在Qa可b/QaQb诚迁期间的半酿、和卵2。在3400cnT哺3629cnTi的宽 正谱带和宽负谱带已经归因于RC中与Qa7QaW及Qc7Qc跃迁相关的水伸缩振动。
[013引此后，我们已经将额外的亲脂Qi。连同两种蛋白质一起共重构。全部谱带均增加， 因此证实酿种类的归属。随后允许第一次光照后获得的稳态在暗处弛豫。全部谱带均下降， 如图7中的一些例子所显示，所述例子W吸光度对弛豫时间的曲线显示。剩余谱带显示相 似的行为，尽管在不同吸光度范围内。
[0139] 最后，光-暗吸光度光谱不仅在额外的Qi。存在下记录，还在添加至水相的（氧化 型）细胞色素C存在下记录（图8)。该种导致上文描述的全部谱带可察觉地下降。该种 下降显示光活化的RC与bci复合体实质地相互作用，但是仅当借助卵2输送至be1复合体 的电子用来还原CC时才该样。该与1434cnTi处卵2标记谱带下降一致，所述下降向be1复 合体提供还原当量，而RC内部归属半酿种类的1360cnTi处谱带下降与卵2借助半酿形成一 致。
[0140] 在表1中汇总谱带归属。
[0141] 表1;在连续照亮下ptBLM中与bci复合体共重构的RC的标记谱带的假定谱带归 属。
[0142]
[0143] 该显示膜蛋白复合物相互作用可W在束缚于固态表面（该里是Au表面）的人工 脂质双层中建模，观察并分析它们的反应，该里通过ATR-SEIRA-光谱法观察和分析。可W 对具有用于RC和bci复合体同时建模的人工束缚型双层的任何粒子预期类似的结果。
[0144] 实施例18 ;CcO生物测定（确定活性）的参数是紧邻珠的质子浓度改变和随电子 传递巧T)入CcO而变化的膜电位Acp演化的改变。该些参数从CcO的酶活动期间电子和质 子途径衍生，所述酶活动由来自cytC的ET或可选地由Ru络合物的光激发过程引发（图 14)。生物测定的参数；A化Acp,根据
[0145]
[0146] 实施例19;渗入基于NTA官能化琼脂糖凝胶的PLB中的CcO的生物测定（运输质 子、形成ApH)
[0147] 通过作为抑指示剂使用的巧光素标记的PLB的光谱变化，测试通过钉络合物进行 光活化后借助CcO的质子运输。图15和图16显不与义用/不义用额外白光暴露相比，具 有/没有苯胺/3-駿基-2, 2, 5, 5-四甲基-1-化咯烷基氧化物/钉络合物的琼脂糖-PLB Tris-HCl/KCU5mM/35mM)。质子释放由巧光发射减少指示（仅可W在低离子强度和低缓冲 容量时检测到）。
[0148] 实施例20;基于NTA官能化娃纳米粒子（NTASiNP)的PLB
[0149] 将NTASiNP(25nm公称直径）与如所述的KCl/KPi缓冲液（100/50mM)中溶解的 CcO温育并且与孤MKCl/KPi缓冲液中的DiPhyPC混合后透析。结合作用和膜形成由NP尺 寸增加指示，尺寸增加由光散射实验显示（图17)。
[0150] 可W通过温育期间变动粒子（该里是NTASiN巧对CcO浓度之比，控制CcO分子 的填充密度。NTASiNP的尺寸随添加的CcO而增加并在越过最大值后下降，而粒子尺寸分 布下降（图18)。该表明水和去垢剂分子包围的结合型CcO分子的量渐增，其中如果填充 达到某个阔值，则所述CcO分子被挤出单层。对于其他实验，我们使用平均CcO浓度用于温 育。
[015。 如此制备的基于NTASiNP的PLB在尺寸方面小到足W允许CcO的透射UV/VIS测量，如溶解的、结合于NTASiNP和渗入PLB的CcO的光谱所示（图19)。CcO功能上完 整，如连二亚硫酸钢化学还原之前和之后的光谱所示。光谱的基线或多或少地因NP的光散 射作用升高，所述光散射作用仍然没有导致光谱模糊。
[0152] 基于NTASiNP的PLB太小，W至于不能由LSM区分。然而，激光激发后 二-8-ANEPPS和二-4-AN抓地S的连续巧光发射显示脂质双层膜形成，因为该些染料只有在 它们插入脂质膜时才显示巧光。
[0153] 还通过在Tris-HCl/KCU5mM/35mM)中温育和透析，制备基于NTASiNP的PLB。 二-4-ANBD地S的均匀巧光发射表示双层脂质膜形成（图20)。
[0154] 实施例21;渗入基于NTA官能化SiNP的PLB的CcO的生物测定
[0155] 作为又一个生物测定，使用定制巧光光谱法测量系统（图21)和通过在Tris-HCl/ KCU5mM/35mM)中温育和透析制备的基于NTASiNP的PLB，通过巧光光谱法检测到CcO被 钉络合物光活化后膜电位的生成。
[0156] 实施例22;基于NTA官能化琼脂糖凝胶的PLB的稳定性
[0157] 将PLB在KCl/KPi缓冲液（100/50mM)中如所述那样制备并用二-8-ANEPPS和 二-4-AN抓地S标记。通过LSM拍摄的图像显示，脂质双层在制冷器中储存至少12日后稳 定，3日和12日后拍摄的LSM图像未改变（分别是图9a和图9b)。 。巧引 在不同离子强麼的缓冲溶液中制各的琼胎糖-PLB:稳定忡取决于用于温育矛口 透析的缓冲溶液的离子强度。在Tris-HCl/KCU5mM/35mM)(图11)和KCl/KPi缓冲液 (1〇〇/5〇1111)之间不能观察到图像差异（图93、抓、133、10)，而在化13-肥1(51111)(图12)中， 不能再检出AN抓地S标记。
[0159]PLB的冷冻/解冻:通社在KC1/KPi缓冲液（100/50mM)中W4000巧m离屯、1分钟， 浓缩50 基于NTA-琼脂糖珠的PLB。此后，将它们重悬于10%甘油或10%二甲基亚讽 值MS0)在KCl/KPi缓冲液（100/50mM)中的溶液内，在室温在甘油缓冲液和DMS0缓冲液中 分别温育20分钟和30分钟，并储存在-80°C的深冷器中直至进一步使用。
[0160] 深度冷冻和解冻后的PLB在重悬于DMS0缓冲液或（图13a)或甘油缓冲液中之后 稳定，而它们在纯粹的含水KCl/KPi缓冲液中崩塌（图13b)。
【主权项】
1. 一种纳米化或微米化粒子，其包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一层在膜蛋白之间 占据并包封所述粒子的脂质双层，其中所述膜蛋白通过长度最多5. 5nm的接头分子固定到 粒子表面上。2. 根据权利要求1所述的粒子，其特征在于脂质双层包膜和粒子表面之间的含水溶 剂。3. 根据权利要求1或2所述的粒子，其中粒子的尺寸在5nm至1mm、优选30nm至 900 y m、或200nm至800 y m、优选800nm至600 y m、特别优选L 5 y m至500 y m、甚至更优选 10 y m至200 y m的范围内。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的粒子，其中所述接头具有至少0. 5nm、优选至少 Inm的长度和/或具有最多Inm的横向尺度。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的粒子，分散于含水溶剂中。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的粒子，其中所述粒子具有或包含选自如下材料： 聚合物、优选地碳水化合物聚合物、金属或准金属、优选地Ag、Au、Si、Ti、Ta、GeAs或碳纳米 粒子。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的粒子，其中与所述固定化膜蛋白不同的又一种 膜蛋白包含于所述脂质双层中。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的粒子，其中所述脂质双层是一个双层两性分子 膜，优选地其中所述分子包含大小(：6至C 3(|、优选地(：8至C 26的疏水性部分。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的粒子，包含黏附于所述脂质双层的又一种蛋白 质。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的粒子，其中在脂质双层内固定到或未固定到粒 子表面上的膜蛋白或黏附于所述脂质双层的蛋白质选自整联蛋白、离子通道、转运蛋白、膜 受体、外周蛋白质、膜结合蛋白、氧化还原蛋白。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的粒子，其中脂质双层内的膜蛋白相对于粒子 表面一致地取向。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的粒子，包含与脂质层连接的适于将粒子与表 面、优选地微量滴定板孔表面接合的锚定分子或基团。13. 制造根据权利要求1至12中任一项所述的具有脂质双层包膜的粒子的方法，包括 步骤：提供纳米化或微米化粒子，将膜蛋白固定至粒子表面上，添加适合形成脂质双层的两 性分子，因此提供具有所述脂质双层包膜的粒子。14. 检验膜蛋白的生物活性的方法，包括提供根据权利要求1至12中任一项所述的粒 子并且分析在包封粒子的脂质双层内的膜蛋白的生物活性。15. 分析膜蛋白结合候选结合物质的能力的方法，包括提供根据权利要求1至12中任 一项所述的粒子，添加候选结合物质并确定所述候选结合物质和在包封粒子的脂质双层中 的膜蛋白的结合事件。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述候选结合物质是可能改性所述膜蛋白的生 物活性的候选活性物质，其中确定结合事件的步骤包括确定所述膜蛋白的目的生物活性的 步骤。17. 根据权利要求14或16所述的方法，其中所述生物活性选自酶促反应、分子或离子 运输，优选地通过离子通道运输离子和配体结合作用。18.制备耐用性可复水具有脂质双层的粒子制品的方法，包括提供根据权利要求1至 12中任一项所述的粒子并冷冻所述粒子，优选地急骤冷冻所述粒子。
【专利摘要】本发明涉及包围纳米化或微米化粒子的模型脂质双层，所述粒子包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一层在膜蛋白之间占据并包封所述粒子的脂质双层，其中所述膜蛋白通过长度最多5.5nm的接头分子固定到粒子表面上，以及在膜蛋白配体结合或活性测定中使用所述粒子的方法。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN104981694
【申请号】CN201380072794
【发明人】R·瑙曼, C·诺瓦克
【申请人】Ait奥地利技术研究所有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】CA2895275A1, EP2746772A1, EP2746772A8, EP2936154A1, US20150346198, WO2014096324A1