，所W垂直偏振光不能有 效穿透导电层。用液氮冷却的光伏蹄簡隶（MCT)检测器测量全反射的IR束强度。在无氧条 件下在28°C进行IR测量。用无二氧化碳的干燥空气吹扫样品装置。使用Blac化am-Harris 3-term变迹和零填充系数2,W4cnTi分辨率记录FTIR光谱。干设图W双侧模式测量并使 用化wer相位校正模型变换成光谱。使用软件包0PUS7和化iginL油'S化igin软件分析 光谱。
[0103] 用白光进行光照，所述白光来自从Dolan-Jenner(Boxborou曲，MA)获得的光纤实 施的Fiber-LiteDC950照明器（150W，面素石英灯）。
[0104] 实施例9 ;在基于琼脂糖珠的PLB中通过LSM转运质子
[010引 40 y 1琼脂糖-PLB小珠与1ml Tris-肥1/KC1缓冲剂巧mM/35mM，抑8)和20 y 1 巧光素溶液（2mg/10ml氯仿）混合。在20分钟温育后，通过淋洗、离屯、（400化pm，1分钟，Heraeus Rresco Micro离屯、机，Thermo Scientific)并重悬，在无染料的Tris-HCl/KCl缓 冲液巧/35mM)中洗漆样品3次。
[010引实施例10 ;娃-蛋白质-脂质-珠（Si-PLB)的制备
[0107]Ni-NTA官能化的25nm二氧化娃纳米粒子（Si-NP)W25mg/ml的浓度购自Kisker Biotech。将 266. 7y1Si-NP用DDMDPK缓冲液（0. 05MK2HP04,0. 1MKC1，pH= 8,0. 1% 孤M)稀释至400y1。360y1 ( = 6mgSi-NP)该种稀释物与300y1 10yMCcO溶液混合， 溶解于DDMDPK缓冲液中，并温育2小时，在此期间温和转动。此后，从CarlRoth获得的 Spectra/化rFloat-a-Lyzer(MWC0 ;500-1000Da)(体积 5ml)用 840y1 40yMDiPhyPC悬 液（用孤MDPK缓冲液稀释）和660y1Si-NP-CcO混合物填充。将该种样品在室温在IL DPK缓冲溶液中透析，在2、4-6和10-14小时后更换透析液。在最后更换后，透析继续进行 2小时。
[0108] 实施例11 ;NTA-Si-NP的光散射测量
[0109]在Malvern "Zetasizer Nano ZS"(散射角；173。）中实施Si-NTA-NP的光散射 测量。将Si-NP用孤MDPK缓冲液稀释至浓度lmg/mU960y1孤MDPK中的40y1Si-NP)。 将该个样品混合并在一次性"聚苯己締"比色皿（体积1ml)中测量，5轮10次测量。
[0110] 向样品巧60y1DDMDPK中的 40y1Si-NP)逐步添加CcO溶液（10-80y1，10y1 递进CcO母液10yM，溶解于孤MDPK缓冲液中）。
[0111] 测量1ml本体体积中ImgSi-NP和20-50y1 (也是10y1递进）CcO悬液的固定 浓度。在1. 5ml微量离屯、管中制备该些样品，之后将它们填充至聚苯己締比色皿中。
[0112] 实施例 12 ;NTA-Si-PLB的UV-VIS测量
[0113] 在1.5ml微量离屯、管中混合如下文所述那样制备的样品，填充于精度小室 (HellmaAnal5rtics，lmm光程）中并在分光光度计化itachiU-2900)中测量。
[0114] 测量W下样品的吸收谱：
[01 巧]仅溶解的CcO(50y1CcO溶液 10yM，200y1 孤MDPK)
[0116]仅Si-NP(40y1Si-NP储料（25mg/ml)，210y1DDMDPK)
[0117]Si-NP连同结合的CcO(40y1Si-NP母液（25mg/ml)，50y1CcO溶液 10yM， 160y1DDMDPK)
[om]Si-PLB(250y1Si-PLB溶液，浓度与含有CcO的Si-NP相同）
[0119] 在每次测量后，含有CcO的样品与一些亚硫酸氨钢晶体（SigmaA1化ich)混合W 测量还原型CcO的光谱。
[0120] 实施例 13 ;Si-PLB的LSM
[012U将 240y1Si-PLB溶液与 152y1DPK缓冲液和 8y1 二-4-AN抓地S染料（Loew， 2mg/10ml无水己醇）混合并且在共聚焦巧光显微镜中测量。
[0122] 实施例14 ;在脉冲灯激发Ru络合物后Si-NTAPLB的巧光光谱法
[0123] 制备Si-PLB溶液并用二-4-AN抓地S标记，并含有用于脉冲灯激发的苯胺、Ru(联 化晚）2双菲咯咐和3-駿基-2, 2, 5, 5-四甲基-1-化咯烷基氧化物。通过将240y1Si-PLB 溶液与 8y1 二-4-ANBDQBS溶液、142y1 缓冲液巧mlTris-肥l/35mMKCl)和 10y1 由母 液5〇11113-駿基-2,2,5,5-四甲基-1-化咯烷基氧化物（在甲醇中）、50〇1111苯胺（在己 醇中）、2. 5mMRu(联化晚）2双菲咯咐（在己膳中）和缓冲液巧mlTris-肥l/35mMKC1) (1:1:1:7)的混合物制成的溶液分别混合，做到该一点。
[0124] 在脉冲灯激发Ru络合物之前和之后测量如此制备的Si-PLB。
[01巧]实施例15 ;结果-细胞色素C氧化酶
[0126] 将膜蛋白重构至双层脂质膜中W形成图1中示意性显示的所谓蛋白质-脂质珠， PLB。作为首个示例，展示了次氮基=己酸（NTA)修饰的微米大小琼脂糖珠，其中将化S标签 与亚基I连接的脱氮副球菌细胞色素C氧化酶（CcO)借助化S标签技术固定到所述琼脂糖 珠上。如此制备的PLB可W通过激光扫描共聚焦显微术（LSM)便利地研究（Claxton，N.，S.; Fellers,T.J. ;Davidson,M.W.LaserScanningConfocalMicroscopy.Oxford,Bios Scientific化blishers, 1987;第1979卷），尤其当该珠与基底的表面连接时。可W使用 选择的巧光探针，将蛋白质/膜系统内部或与之紧邻的物理参数的变化作为时间的函数监 巧。。也可W通过表面-等离子体增强型巧光光谱法（SPF巧检测时间依赖性变化。
[0127] 通过His标签技术定向固定膜蛋白是一项充分建立的方法。先前已经在扁平面 上研究了向双层脂质膜中重构，因而使用固定化蛋白质作为支架（Giess等人，Bio地ys J2004, 87, 3213Baumann等人，SoftMatter2011,7, 9535;Kibrom等人，Soft Matter, 2011，7, 237-246)。在微米规模凝胶珠的情况下，巧光标记的脂质如NBDPE可W用 来通过LSM可视化自装配的双层脂质膜（图2a)。已经通过458nm多路-Ar激光束激发NBD 阳。用已经向其中共重构二植烧酷磯脂值化yPC)、NBD-PE和巧PC的PLB获得图像。疏水 性巧错定基团设计成将珠连接至流动小室的表面。在该些条件下，PLB黏附至该表面，从而 经受住由缓冲水溶液通过引起的流体应力。另外，电压敏感性探针，如二-8-ANEPPS可W添 加至浸泡溶液。采用488nm氣激光束激发的二-8-ANEPPS时，巧光谱显示双层脂质膜的存 在，因仅渗入双层脂质膜中的二-8-A肥PPS产生检出的巧光强度（图化）。非特异性结合的 或含水本体相内部存在的二-8-ANEPPS具有104倍更低的巧光强度。图2a和图化中所示 的图像显示珠周围一个厚度规律的层。然而，已知双层脂质膜本身在二氧化娃珠上自装配。 因此，作为对照实验，将凝胶珠在无固定化CcO的情况下进行透析。可W在二-8-ANEPPS存 在下见到双层脂质膜，然而，比固定化膜蛋白存在下的双层脂质膜更宽和更模糊（图2d): 另一个阴性对照由尝试标记用二-8-ANEPPS仅固定化CcO组成。最后，将近红外电压敏感 性巧光染料二-4-AN抓地S插入、由化Ne激光激发，该再次显示界定良好的包围珠的双层脂 质膜（图2c)。迄今，在珠的赤道面记录图像（图3a)。焦平面调节至PLB顶部的激光扫描 图像显示直径更小的连续巧光，如对完全覆盖珠的封闭型双层脂质膜所预期那样（图3b)。 从该些结果得出结论：使用膜蛋白作为支架导致界定良好的均匀覆盖整个珠表面的脂质双 层。
[0128] 用连接至亚基I的His标签固定的CcO随细胞色素C结合位点取向，指向膜的外 部。对亚基I和亚基II均特异性的兔多克隆第一IgG-抗体与PLB结合。随后，切5缀合 物第二抗体与第一IgG结合并且通过化Ne激光在633皿激发切5标记物。与使用膜结合 型标记物获得的强度相比，由低巧光强度指示CcO的存在（图4)。该显示与脂质相比嵌入 脂质层中的蛋白质的填充密度相对低。
[0129]CcO是呼吸链的末端复合体。它将因氧还原成水所获得的自由洽转化成质子 Ay~H+跨脂质膜的电化学电势差异。较大部分的Ay~H+是膜电位AO。因此，CcO 在PLB内部的功能可W由电压敏感性染料展示。如从电计量测量熟知，当CcO在氧存在下 由细胞色素C和抗坏血酸还原时，A0按毫秒时间尺度生成炬elevich等人，Proc.化tl. Acad.Science2007, 104, 2685)。因此，使用LSM在相同条件下测量A巫。使用二-8-ANEPPS 的比率测量将是备选方法，然而，二-8-ANEPPS的发射光谱显示在Q-能带区与细胞色素 C的消光光谱明显重叠。另外，细胞色素C与CcO的强静电结合可W导致细胞色素C和 二-8-ANEPPS的空间隔离缩减，该可能导致二-8-ANEPPS发射因F6rs化r转移而巧灭。静 电结合还可能影响蛋白质内部的偶极电势，如二-8-ANEPPS的巧光强度增加所示，该种增 加几乎是相同的，无论还原型或氧化型细胞色素C是否已经与PLB结合。
[0130] 为了克服该些问题，将脂质膜用近红外电压敏感性巧光染料二-4-AN抓地S标 记(LoewBioelectromagnetics, 1992, 13, 179-189;Matiukas等人，AmericanJournal of化ysiology-heartandCirculatory化ysiology,2006, 290,H2633-H2643)。 二-4-AN抓地S具有宽发射谱带，最大值在约766nm，因此可忽略细胞色素c消光的光谱重 叠。将680-720nm带宽内部的巧光发射强度在PLB的赤道面中作为时间的函数监测。将细 胞色素C和抗坏血酸添加至空气饱和的溶液。W分钟时间尺度观察强度变化，当仅添加抗 坏血酸时，所述观察强度变化受试剂扩散限制，接着在添加细胞色素c和抗坏血酸后是时 间尺度100毫秒的一个快速相（图5A)。该个快速相归因于因CcO在氧存在下由细胞色素C 和抗坏血酸还原时质子转移所致的膜电位生成炬elevich等人，Proc.化1:1.Acad.Science 2007, 104, 2685)。继快速相之后我们观察到第二缓慢相，我们根据膜电位因离子被动运 输而缓慢弛豫对此解释-参见图5A(Robe;rtson等人，Journalof化ysicalQiemistry B(2008)，112(34)，10475-10482)。
[0131]该个结果由SPFS证实（Neumann,T.;Johansson,M.L. ;Kambhampati,D. 和Knoll,W.AdvancedFunctionalMaterials,Wiley-vCHVerlag Gmbti，2002, 12, 575-586)。用二-4-AN抓地S标记的来自His标签与亚基I连接的CcO的 P化与50nm金层顶部上薄光阻剂膜的疏水性表面接合。在仅添加抗坏血酸后和在细胞色 素C存在下记录SPR共振角和SPF强度的时间依赖性变化。（图5B)。在两种情况下，当仅 添加抗坏血酸时观察缓慢相，接着在添加抗坏血酸和细胞色素C后是一个快速相。SPFS迹 线中的快速相反映因膜电位生成所致的强度变化，而SPR迹线中的快速相反映因细胞色素 C结合所致的厚度增加。该种解释与观察的但仅在中SPFS迹线中的第二缓慢相一致，我们 已经在上文根据膜电位因离子被动运输而缓慢弛豫对此解释。
[0132] 该些结果显示CcO已经W功能