水（18.2MQcm)。氯化钟胁1，> 99% )、磯酸氨二钟化2册〇4,分析纯）、 十二烷基-0-〇-麦芽糖巧抑通，>98%)、来自牛屯、脏的细胞色素〇(巧*(3，〉95%)购自 Si卵a-Al化ich。L(+)-抗坏血酸（> 99% )购自Carl-Ro1:h。1, 2-二植烧酷-sn-甘油-3-磯 酸胆碱（Di化yPC，>99% )和1，2-二油酷-sn-甘油酷-3-磯脂酷己醇胺-N-(l-巧横酷基） 巧-DOPE(巧，>99%)购自Avanti化larLipids。电位敏感性巧光染料二-8-ANEPPS(二-8-了 基-氨基-蒙基-亚己基-化晚嗦-丙横酸醋），二-4-ANBD孤S(4- (1- [2-(二-正了基）-6-蒙 基]-4-了二締基）-1-(4-了横酷基）嗟咐鐵甜菜碱），和磯脂NBD-PE(1，2-双十六碳酷-sn-甘 油酷-3-磯酷-(N-[4-硝基苯-2-曠-1, 3-二挫基）己醇胺）购自Invitrogen。根据IXlrr 等人（JournalofMolecularBiology2008, 384, 865-877)表达并纯化来自脱氮副球菌 (Paracoccusdenitrificans)的具有工程化至亚基IC末端的His标签的细胞色素C氧化酶 肪0)。
[0080] 用天然CcO制备物免疫后，获得兔多克隆第一抗体，此处作为与亚基I和II特异 性反应的富集IgG级分使用。第二抗体，山羊抗兔IgGH&L(切5)，购自Abeam。50-150 ym 琼脂糖珠化sPurNi-NTA树脂购自ThermoScientific。用于蒸锻的金粒子巧9.99% )购 自MateckGmbH(Juelich，德国）。根据Wuskell等人（JournalofNeuroscienceMethods 2006, 151，200-215)合成二-8-AN抓地SoSU8 光阻剂购自microchem。
[0081]实施例2 ;制备载有细胞色素c氧化酶的蛋白质-脂质-珠（PLBs):
[008引将20%己醇中混悬的0. 5血His化rNi-NTA树脂反复地淋洗，在5xl03巧m离屯、 化eraeus化esco微量离屯、机，ThermoScientific)l分钟并重悬，首先在超纯水中，随后在DPK缓冲溶液中（0. 05M馬册04,0. 1MKC1，抑=8)和最终在孤MDPK缓冲液（0. 05M馬册04， 0. 1MKC1，抑=8,0. 1%孤M)中。此后，将溶解于孤MDPK缓冲液中的CcOW终浓度197nM 吸附到Ni-NTA官能化表面。在2小时吸附时间后，将珠再次淋洗，离屯、并重悬于孤M磯酸 盐缓冲液中，W移除非特异性吸附的蛋白质。
[0083]透析；
[0084]从Carl Roth获得的Spectra/化r Float-A-Lyzer (MWC0 ;500-1000Da)(体积5ml) 用4ml Di化yPC-巧DOPE在孤M-DPK缓冲液中的溶液（1:10)和载有CcO的琼脂糖珠填 充。在N抓-PE标记的蛋白质-脂质-珠的情况下，将2. 6化1. 9mM N抓-PE母液在灌注 Float-A-Lyze之前添加至DiWiyPC-巧DO阳溶液至N抓-阳终浓度12. 2 y M。样品在1L DPK 缓冲溶液中在室温透析24小时，在1、2、4、14、18和22小时后完全更换透析液六次。
[00财用电位敏感性巧光染料任S抑）标记；
[0086] 在无水己醇溶液中W 2mg/10血的浓度制备PS抑二-4-AN抓地S的母液。通过W下 方式制备二-8-A肥PPS的母液：将粉末溶解W 2mg/10mL比例在DMS0中。将20 y L母液添加 至载有CcO的PLB悬液至终浓度分别是6. 6 y M和6. 9 y M二-8-ANEPPS或二-4-AN抓地S。 在温育15-20分钟后，通过淋洗、离屯、和重悬，将PLB在无染料的PBS缓冲溶液中洗漆3次。
[0087] 实施例3 ;激光扫描共聚焦巧光显微术（LSM)
[008引LSM测量在具有lOx干式物镜的直立式LeicaTCSSP5II显微镜（Leica，肥 PLAP010X/0.40C巧中实施。疏水性巧错定基团，将蛋白质-脂质-珠连接至流动小室 的疏水性表面（y-slideupri曲t,ibidiGmbH,Munich,德国），因此耐受由缓冲水溶 液流通直至流速500]il/分钟所引起的流体应力（IPC,Ismatec,IdexHealth&Science group,Glat忧urg，瑞± )。多重氣气激光器458nm或488nm光束或可选地化-Ne激光器的 红色633nm光束分别用于激发NBD-PE、二-8-ANEPPS或二-4-AN抓地S。
[0089] 在二-8-A肥PPS标记的蛋白质-脂质-珠情况下，测量W双通道比率计模式 巧50-580nm和620-650nm)进行。因为二-4-AN抓地S的发射谱带宽，测量W单通道高模式 实施化80-720nm)(图5C)。为了分析背景噪声在二-4-AN抓地S的情况下，测量也W比率计 模式化30-636nm和 680-720nm)进行。
[0090] 实施例4 ;表面等离子体增强型巧光光谱法（SPF巧
[0091]SPFSW定制设置使用所述的拉'etschmann-布局巧eather, 1977,引自；Haas,G. ,Francombe,M.,比，Hoffmann,R. ,W.,(编著）PhysicsofThinFilms,第 9 卷.Academic Press,NewYork,第 145 页）进行。用 43nm金（HHVEdwardsAuto306，Crawley,UK)涂 锻的玻璃载片（来自化lima化tic,Jena的LaSFN9玻璃，在633皿时折射率n= 1. 8385) 是光学上匹配于45。玻璃棱镜（LaSFN9)基部。二-4-AN抓地S标记的蛋白质-脂质-珠 黏附于金层（SpincoatG3,SpecialtyCoatingSystemsInc. ,Indiana,美国）顶部旋锻 的光阻剂薄膜（来自microchem的SU8,25nm)的疏水性表面上。通过棱镜导引来自He/Ne 激光器扣niphase，SanJose,CA，A= 632. 8nm)的单色光并由订制的光电二极管检测器 检测。从该表面发射的巧光经流动小室由透镜（数值口径NA0.3)采集，通过陷波滤波器 化32. 8nm)和带通滤波器（传输波长A694/10nm)导引并最终由光电倍增管化amamatsu册240-01，日本）检测到。在SPFS动力学的情况下，用PBS淋洗9分钟，用3. 3mMPBS-抗 坏血酸溶液淋洗6分钟和用105yMPBS-抗坏血酸-细胞色素C溶液淋洗20分钟的同时， W入射角0 = 65. 5°测量反射率变化和巧光强度变化（图5B)。
[009引实施例5 ;巧光光谱法
[0093] 使用He-NeRed632. 8nm、10加激光（1135P，JDSUni地aseCo巧oration， Milpitas,美国）实施巧光测量，W激发与如上所述的流动小室疏水性表面连接的 二-4-AN抓地S标记的蛋白质-脂质-珠。从该表面发射的巧光信号由物镜采集并借 助二色分光镜江(：-6600化口-25，激光器亚基，01油1叫，德国）和632.8皿陷波滤波器 (RugateTechnologiesInc. ,Oxford,美国）与反射的激光分离。还使用lOx物镜（MPlan NlOx0. 25NA，OlympusCo;rporation，东京，日本）。通过光谱摄制仪（Andor化amrock 303i，AndorTechnologypic.，Belfast,UK)和冷却至-70°C的CCD光谱法检测器系统 (LOTOrielNewton920P,LOTOrielGmbH,Darmsta化，德国）测量巧光光谱。归因于 二-8-AN抓地S的量子产率低，将数据在10个光谱范围内平均，每个光谱W10秒曝光时间 拍摄。
[0094] 用W下每种水溶液W流速500y1/分钟淋洗5分钟后测量巧光光谱：首先是化饱 和的PBS缓冲溶液，其次是PBS中的33mM抗坏血酸溶液并且第S是PBS中的33mM抗坏血 酸连同105yM细胞色素C溶液（图5C)。
[0095] 时间解析巧光光谱法（tr-F巧
[0096] 在时间解析巧光光谱法的情况下，使用769/41nm带通巧dmund化tics GmbH, 卡尔斯鲁厄，德国）作为发射滤光片。通过与口控时间100ms的225MHz通用频率计数器 巧3131A，Agilent Technologies,BSblillgen,德国）连接的单光子计数模块（SPAD) (COUNT20C-FC，激光器亚基，Olching，德国）检测巧光信号。用W下溶液淋洗的同时测量 巧光发射光子计数的变化；首先用化饱和的PBS缓冲溶液淋洗3. 5分钟，其次用PBS中的 33mM抗坏血酸溶液淋洗4分钟并且用PBS中的33yM抗坏血酸连同105yM细胞色素C溶 液淋洗3分钟（图5A)。
[0097] 实施例6 (比较例）；在设计用于表面增强型FTIR光谱法的平面状双层金表面上 类球红细菌反应中屯、（RC)和bcl复合体的共重构；
[0098] 从紫色非硫细菌类球红细菌表达并纯化在M-亚基C末端处具有遗传工程化化S 标签的野生型RC，根据Crofts等人，（Crofts Protein Expression and Purification 1999, 15, 370)表达并纯化在巧t b亚基C末端上加多His标签的bcl复合体。根据Nowak 等人，（Journal of Solid State Elec1:;rochemist;ry 2011, 15, 105)在金表面上固定蛋白 质。简而言之，将金表面在无水DMSO中摩尔比为0. 25的lOmM DTNTA和lOmM DTP溶液内 浸没20小时。在用己醇和纯化水淋洗后，将该表面在己酸盐缓冲液巧OmM，抑=5.W中 的40mMNiCls内浸没30分钟，随后用纯化水彻底淋洗W除去多余的NiCls。将该表面于氣 气流下干燥，之后在测量小室中组装并用DDM磯酸盐缓冲液值DM-DPK) (0. 05M馬册〇4,0. 1M KC1，pH= 8,0. 1%孤M)再水化。溶解于孤M-DPK中的RC和bcl复合物分别W终浓度lOOnM 吸附到NTA-官能化的金珠上。在28°C进行吸附4小时的时间后，将小室用DDM-DPK淋洗 W移除非特异性吸附的蛋白质和本体蛋白质。此后，将DDM-DPK更换为DiPhyPC/DDM-DPK 溶液值DM-DPK中的40yMDi化yPC)。在额外泛酿的情况下，将QIO与DiPhyPC-起溶解 值iPhyPC/孤M-DPK中的6yMQ10)。通过添加生物珠至DiWiyPC/孤M-DPK溶液，W原位透 析移除孤M。
[009引实施例7 (比较例）；在ATR晶体上制备双层金表面。
[0100]如Nowak等人（AppliedSpectroscopy2009, 63, 1068)先前所描述进行制备。将 抛光娃衰减全反射（ATR)晶体在MPTES的10 %己醇溶液中浸没60分钟W错定金层。在用 己醇淋洗后，将样品在氣气流下干燥并且在l〇〇°C退火60分钟。在冷却至室温后，将晶体 在水中浸没10分钟并在氣气流下干燥。随后通过电化学蒸锻法（HHVEdwardsAuto306， 化awley，UK),将25nm金膜沉积到ATR晶体上。通过W下方式在金膜上长出金纳米粒子；在 50ml盐酸哲胺水溶液化4mM)中浸没晶体，向所述溶液W2分钟间隔添加500y1氯化金 (III)水合物水溶液（〇.3mM) 5次。最后，将样品用水淋洗并在氣气流下干燥。
[0101] 实施例8 (比较例）；Au表面上RC和bcl复合体的ATR-SEIRA-光谱法
[0102] 将Au上固定有RC和bcl复合体的电化学小室安装在梯形单反射娃ATR晶体的顶 部。通过使用先前描述的定制设置（Nowak等人，ApplSpectrosc2009,63，1068)，将FTIR 谱仪（VERTEX70v，来自化址er，Ettlingen，德国）的IR束W入射角0 =60。偶合至晶体 中。用平行偏振光测量全部光谱。因为ATR元件表面用电导体涂锻