行诊断、鉴别诊断、危险分级、监测、分 类和确定治疗方案的方法及组合物。在各种实施方案中，将选自免疫球蛋白A、金属蛋白酶 抑制剂4、以及血栓调节蛋白的一种或多种生物标记物或与其相关的一种或多种标记物的 测定浓度与受试者的肾状态相关联。
[0071] 对于本文件来说，应用以下定义：
[0072] 如本文中所用，"肾功能损伤"是测量的肾功能的急剧的（14天内，优选7天内，更 优选72小时内，还更优选48小时内）可测量的下降。这种损伤可通过例如肾小球滤过率 或估计GFR的减小、排尿量的减少、血清肌酐的增加、血清胱抑素C的增加、对肾替代疗法的 需求等进行识别。"肾功能的改善"是测量的肾功能的急剧的（14天内，优选7天内，更优选 72小时内，还更优选48小时内）可测量的提高。测量和/或估计GFR的优选方法在下文中 描述。
[0073] 如本文中所用，"衰弱的肾功能"是通过大于或等于0?lmg/dL(彡8. 8ymol/L)的 血清肌酐的绝对增加、大于或等于20% (基线的1.2倍）的血清肌酐的百分比增加或排尿 量的减少（文献记载的少尿为每小时不到〇.5ml/kg)确认的肾功能的急剧（14天内，优选 7天内，更优选72小时内，还更优选48小时内）下降。
[0074] 如本文中所用，"急性肾衰竭"或"ARF"是通过大于或等于0. 3mg/ dl(彡26.4ymol/1)的血清肌酐的绝对增加、大于或等于50% (基线的1.5倍）的血清肌 酐的百分比增加或排尿量的减少（文献记载的至少6小时的少尿为每小时不到0. 5ml/kg) 确认的肾功能的急剧（14天内，优选7天内，更优选72小时内，还更优选48小时内）下降。 这一术语和"急性肾损伤"或"AKI"同义。
[0075] 如本文中所用，术语"IgA"指具有两个子类（IgAl和IgA2)的抗体并且可以由J 链链接的二聚体形式存在（称为分泌性IgA，或slgA)。分泌性形式的IgA是粘液分泌物中 发现的主要免疫球蛋白，所述粘液分泌物包含眼泪、唾液、初乳和来自泌尿生殖道、胃肠道、 前列腺以及呼吸上皮组织的分泌物。也在血液中发现少量。IgA可与其它免疫球蛋白（例 如，IgG或IgM)分开测量，例如采用结合IgAa-链的抗体。
[0076] 如本文中所用，术语"金属蛋白酶抑制剂4 "指衍生自金属蛋白酶抑制剂4前体的 生物样本中存在的一种或多种多肽（Swiss-ProtQ99727(SEQIDN0:1))。
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] 如本文中所用，术语"血栓调节蛋白"指衍生自⑶44抗原前体的生物样本中存在 的一种或多种多肽（Swiss-ProtP07204(SEQIDN0:2))〇
[0081] 10 m 30 40 ，〇 60：
[0082]
[0083] 最优选地，血栓调节蛋白测定检测血栓调节蛋白的一种或多种可溶形式。血栓调 节蛋白是一种具有大胞外域的单通I型膜蛋白，其大部分或全部是以通过删除全部或部分 跨膜域的选择性剪切事件或通过膜结合形式的蛋白水解产生的血栓调节蛋白的可溶形式 存在的。在免疫测定的情况下，在此胞外域内结合于表位的一种或多种抗体可用于检测这 些可溶形式。在血栓调节蛋白中已确定了以下域：
[0084]
[0085]如本文中所用，术语"将信号与分析物的存在或数量相关联"反映的是这种理解。 一般通过使用由已知浓度的所关注的分析物计算的标准曲线将测定信号与分析物的存在 或数量相关联。当术语如本文中所用，如果测定可产生指示生理相关浓度的分析物的存在 或数量的可检测信号，则将测定"设定成检测"分析物。因为抗体表位有大约8个氨基酸， 所以设定成检测所关注的标记物的免疫测定也检测与标记物序列相关的多肽，只要这些多 肽含有与测定所用的抗体结合所必需的表位。本文中关于生物标记物所用的术语"相关标 记物"（如本文中所述的肾损伤标记物之一）指特定标记物或其生物合成母体的一种或多 种片段、变体等，其可作为标记物本身的替代物或单独的生物标记物进行检测。该术语也指 衍生自生物标记物前体与别的物质（如结合蛋白、受体、肝素、脂质、糖等）复合的生物样本 中存在的一种或多种多肽。
[0086] 关于这点，技术人员应了解自免疫测定获得的信号是一种或多种抗体与靶标生物 分子（即分析物）与含有抗体结合的必要表位的多肽之间形成复合物的直接结果。虽然所 述测定可检测全长生物标记物并且测定结果表示为所关注生物标记物的浓度，但测定信号 实际上是样品中存在的所有该等"免疫反应性"多肽的结果。生物标记物的表达也可通过以 不同于生物测定的方法确定，包含蛋白测定（例如，斑点杂交、蛋白印记、色谱法、质谱等） 和核酸测定（mRNA定量）。此列举并不意味限制。
[0087]如本文中所用的术语"阳向"标记物指相对于未罹患疾病或病症的受试者来说，在 罹患该疾病或病症的受试者中确定升高的标记物。如本文中所用的术语"阴向"标记物指 相对于未罹患疾病或病症的受试者来说，在罹患该疾病或病症的受试者中确定降低的标记 物。
[0088] 如本文中所用的术语"受试者"指人或非人类生物体。因此，本文中所述的方法和 组合物适用于人和动物的疾病。此外，虽然受试者优选为活生物体，但本文中所述的发明也 可用于死后分析。优选的受试者是人，最优选的是"患者"，本文中所用的"患者"是指接受 疾病或病症的医疗护理的活人。这包括未患所确定的疾病而正进行病理体征研究的人。 [0089]优选地，测量样本中的分析物。这种样本可得自受试者，或可得自旨在提供给受试 者的生物材料。例如，样本可得自对可能移植到受试者当中而进行评价的肾，分析物测量用 于评价肾预先存在的损害。优选的样本是体液样本。
[0090] 如本文中所用的术语"体液样本"指出于诊断、预后、分类或评价所关注的受试者 (如患者或移植捐赠者）的目的而获得的体液样本。在某些实施方案中，可出于确定进行 中的病症的结果或治疗方案对病症的影响的目的而获得这种样本。优选的体液样本包括血 液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰和胸腔积液。此外，本领域技术人员将意识到，某些体 液样本在分馏或纯化步骤后（例如，将全血分离成血清或血浆组分）更易于分析。
[0091] 如本文中所用术语"诊断"指技术人员可估计和/或确定患者是否罹患给定疾病 或病症的机率（"可能性"）的方法。在本发明的情况下，"诊断"包括使用对本发明的肾损 伤标记物的测定的结果，最优选为免疫测定的结果，任选连同其它临床特征一起，以实现对 获得并测定了样本的受试者的急性肾损伤或ARF的诊断（即，是否出现）。诊断得以"确 定"并不意味着诊断是100%准确的。许多生物标记物可指示多种病症。熟练的临床医生 不使用信息缺乏的生物标记物结果，而是将测试结果与其它临床标识物一起使用来得出诊 断。因此，在预定诊断阈值一侧上的测定生物标记物水平相对于在预定诊断阈值另一侧上 的测定水平表示受试者出现疾病的可能性更大。
[0092] 类似地，预后危险表示出现给定过程或结果的概率（"可能性"）。
[0093] 预后指标水平或预后指标水平的变化（其又与发病概率的增加有关，例如肾功能 恶化、日后ARF或死亡）被认为是"表示"患者出现不利结果的"可能性增加"。
[0094] 标记物测定
[0095] 通常，免疫测定涉及使含有或怀疑含有所关注的生物标记物的样本与至少一种 特异性结合生物标记物的抗体接触。然后产生表示通过样本中的多肽与抗体或其它结合 物种的结合所形成的复合物的存在或数量的信号。然后将信号与样本中生物标记物的 存在或数量相关联。检测和分析生物标记物的多种方法和装置是技术人员熟知的。参 见例如美国专利 6, 143, 576、6, 113, 855、6, 019, 944、5, 985, 579、5, 947, 124、5, 939, 272、 5, 922, 615、5, 885, 527、5, 851，776、5, 824, 799、5, 679, 526、5, 525, 524 与 5, 480, 792,和The ImmunoassayHandbook,DavidWild,ed.StocktonPress,NewYork, 1994,上述每个文献据 此以引用的方式全文并入，包括所有的表格、附图和权利要求。
[0096] 本领域中已知的测定装置和方法可在各种夹心、竞争或非竞争性测定形式中利用 标记的分子以产生与所关注的生物标记物的存在或数量相关的信号。合适的测定形式还包 括色谱法、质谱法和蛋白质"印迹"法。另外，可使用某些方法和装置（如生物传感器和光 学免疫测定）来确定分析物的存在或数量，无需标记的分子。参见例如美国专利5, 631，171 和5, 955, 377,上述每个专利文献据此以引用的方式全文并入，包括所有表格、附图和权利 要求。本领域技术人员也会认识到，自动仪表装置（包括但不限于BeckmanACCESS?、 AbbottAXSYM?、RocheELECSYS?、DadeBehringSTRATUS?.系统）属于能 够进行免疫测定的免疫测定分析仪。但可利用任意合适的免疫测定，例如酶联免疫测定 (ELISA)、放射免疫测定（RIA)、竞争结合测定等。
[0097] 可将抗体或其它多肽固定在多种固体载体上以用于测定。可用于固定特异性结合 成员的固相包括在固相结合测定中开发和/或用作固相的那些。合适固相的实例包括膜 过滤器、基于纤维素的纸、珠（包括聚合、乳胶和顺磁性颗粒）、玻璃、硅片、微粒、纳米粒子、 TentaGel、AgroGel、PEGA凝胶、SP0CC凝胶和多孔板。可以通过将抗体或多种抗体以阵列 的形式涂覆在固体载体上制备测定条。然后将该测定条浸入测试样本中，然后通过洗涤和 检测步骤快速处理，以产生可测量的信号，如染色斑点。抗体或其它多肽可通过直接配合至 测定装置表面或通过间接结合而结合至测定装置的特定区域。在后一种情况的一个实施例 中，可将抗体或其它多肽固定在颗粒或其它固体载体上，并且该固体载体固定至装置表面。
[0098] 生物测定需要检测方法，量化结果的最常用的方法之一是将可检测的标记物配合 至对所研究的生物系统中的组分之一具有亲和力的蛋白质或核酸。可检测的标记物可包括 自身可检测的分子（例如，荧光部分、电化学标记物、金属螯合物等）以及可通过产生可检 测的反应产物（例如，酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）或通过自身可检测的特异性 结合分子（例如，生物素、地高辛、麦芽糖、寡聚组氨酸、2, 4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、 dsDNA等）而被间接检测的分子。
[0099] 制备固相和可检测的标记物配合物通常包括使用化学交联剂。交联试剂含有至少 两个反应性基团，且通常分为同官能交联剂（含相同的反应性基团）和异官能交联剂（含 不相同的反应性基团）。通过胺、巯基偶合或非特异性反应的同双官能交联剂可购自多个商 业来源。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、a-卤代酰基和吡啶基二硫化物是硫醇反应性基 团。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物和a-卤代酰基与巯基反应形成硫醚键，而吡啶基二硫 化物与巯基反应产生混合二硫化物。吡啶基二硫化物产物是可裂解的。亚氨酸酯也非常适 用于蛋白质-蛋白质交联。多种异双官能交联剂（各结合了用于成功配合的不同属性）是 市售的。
[0100] 在某些方面，本发明提供用于分析所述肾损伤标记物的试剂盒。该试剂盒包含用 于分析至少一个测试样本的试剂，该测试样本包含至少一种抗体肾损伤标记物。该试剂盒 还可包括进行本文中所述的一种或多种诊断和/或预后关联的装置和说明书。优选的试剂 盒包含用于对分析物进行夹心测定的抗体对或对分析物进行竞争性测定的标记的物质。优 选地，抗体对包含与固相配合的第一抗体和与可检测的标记物配合的第二抗体，其中第一 和第二抗体各自结合肾损伤标记物。最优选地，各抗体是单克隆抗体。关于使用试剂盒和 进行关联的说明书的形式可以是标签，其是指在制造、运输、销售或使用期间的任一时刻附 属于或另随附于试剂盒的任何书面或记录材料。例如，术语标签包括了广告传单和小册子、 包装材料、说明书、录音带或录像带、计算机磁盘和直接印在试剂盒上的字迹。
[0101] 抗体
[0102] 如本文中所用，术语"抗体"是指衍生自、仿效或基本上由免疫球蛋白基因或 多种免疫球蛋白基因或其片段编码的能够特异性结合抗原或表位的肽或多肽。参见 例如FundamentalImmunology,第三版，W.E.Paul编著，RavenPress，N.Y. (1993); Wilson(1994 ；J.Immunol.Methods175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys. Methods25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即保留结合抗原能力的"抗原结合位 点"（例如，片段、子序列、互补决定区（⑶R))，包括（i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成 的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段； (iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；（iv)由单臂抗体的VL和VH域组成的Fv片段；（v)dAb片段（Ward等，Nature341:544-546 (1989))，由VH域组成；和（vi)孤立的互补决定区 (CDR)。单链抗体也以引用的方式包括在术语"抗体"中。
[0103] 本文中所述的免疫测定中所用的抗体优先地与本发明的肾损伤标记物特异性结 合。术语"特异性结合"并非旨在表明抗体专门与其预期的靶标结合，因为如上所述，抗体 与显示抗体结合表位的任何多肽结合。而是，如果抗体对其预期的靶标的亲和力比其对不 显示适当表位的非靶标分子的亲和力大约5倍，则抗体"特异性结合"。优选地，抗体对靶标 分子的亲和力是其对非靶标分子亲和力的至少约5倍，优选为10倍，更优选为25倍，甚至 更优选为50倍，最优选为100倍或更多。在优选的实施方案中，优选的抗体的结合亲和力 为至少约l〇7M\优选为约10SM1至约109M\约109M1至约10i°M1或约10WM1至约1012Mi。
[0104] 按Kd=k计算亲和力（krff是解离速率常数，Km是缔合速率常数，Kd是平 衡常数）。可通过在平衡时测量不同浓度（c)下标记的配体的结合分数（r)来确定亲和 力。利用Scatchard等式：r/c=K(n-r)对数据进行作图：其中r=平衡时每摩尔受体 的结合配体的摩尔数；c=平衡时游离配体浓度；K=平衡缔合常数；n=配体结合位点 数/受体分子。通过作图分析，将r/c绘于Y-轴，将r绘于X-轴上，由此制得Scatchard 图。通过Scatchard分析测定抗体亲和力是本领域中熟知的。参见例如vanErp等，J. Immunoassay12:425-43，1991;NelsonandGriswold,Comput.MethodsPrograms Biomed. 27:65-8, 1988〇
[0105] 术语"表位"是指能够与抗体特异性结合的抗原决定簇。表位通常由分子的化学 活性表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电 荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在的情况下与前者而非后者的结合消 失。
[0106] 许多出版物中讨论了利用噬菌体展示技术来产生和筛选用于与选定分析物结 合的多肽库。参见例如Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,6378-82, 1990;Devlin 等，Science249, 404-6, 1990,Scott和Smith,Science249, 386-88, 1990 ;和Ladner等， 美国专利No. 5, 571，698。噬菌体展示法的基本概念是建立编码待筛选多肽的DNA与多肽之 间的物理缔合。这种物理缔合由噬菌体颗粒提供，该噬菌体颗粒将多肽显示为包围编码多 肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。多肽与其基因物质间的物理缔合的建立允许同时群集 筛选非常大量的带有不同多肽的噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体结合至靶 标，并且这些噬菌体通过对靶标的亲和力的筛选得到富集。由这些噬菌体展示的多肽的种 类可由其各自的基因组来确定。采用这些方法，于是可通过常规的手段大量合成确认对所 需靶标具有结合亲和力的多肽。参见例如美国专利No. 6, 057, 098,该专利据此以引用的方 式全文并入，包括所有表格、附图和权利要求。
[0107] 然后可以对由这些方法产生的抗体进行选择，方式是首先通过与所关注的纯化多 肽的亲和力和特异性进行筛选，如有需要，将结果与抗体同期望排除结合的多肽的亲和力 和特异性相比较。筛选步骤可涉及将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独孔中。然后将含 潜在抗体或抗体组的溶液置入各自的微量滴定孔中并温育约30分钟至2小时。然后清洗 微量滴定孔并将标记的二级抗体（例如，如果培养的抗体是小鼠抗体，则为与碱性磷酸酶 配合的抗小鼠抗体）添加至孔中并温育约30分钟，然后清洗。将底物加入孔中，在对固定 多肽的抗体存在之处出现颜色反应。
[0108] 然后，在选定的测定设计中可以对如此确定的抗体进一步分析亲和力和特异性。 在靶蛋白质免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白质用作标准物，用其判断使用已选定抗体的 免疫测定的敏感性和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能会有所不同；某些抗体对 (例如，在夹心测定中）可能会在空间上彼此