一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于稀有细胞检测领域，具体设及一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人外周血中的循环肿瘤细胞是存在于肿瘤患者外周血中的一类数量稀少却具有 重要临床意义的稀有细胞，它是由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条 件下可发展为肿瘤转移性病灶。血液中的循环肿瘤细胞提示了体内肿瘤的存在W及可能的 转移，而临床上超过90 %的癌症死亡都是由转移造成的，同时血液中的循环肿瘤细胞提供 了体内除了肿瘤病灶W外的肿瘤细胞的来源，因此从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来 越引起人们的重视。
[0003] 循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环 肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的 检测循环肿瘤细胞是此领域面临的挑战。目前唯一获得美国FDA批准的循环肿瘤细 胞检测试剂盒是用于CellSearch?系统的试剂盒，被批准应用于检测转移性乳腺癌、 前列腺癌及结直肠癌患者的预后评估与生存期预测（化istofanilliM，BuddT，Ellis MJ,etal.N.Engl.J.Med. 2004, 351, 781-791；RiethdorfS,FritscheH,MullerV,et al.Clin.CancerRes. 2007, 13, 920-928;CohenSJ,F*untCJA'IannottiN,etal.J.Clin. 化col. 2008, 26, 3213-3221)，运一系统运用标记有针对化CAM抗体的磁性颗粒进行血液中 循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，且需依赖大 型、昂贵的设备。
[0004] 微流控忍片是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操 作单元集成到一块忍片上，自动完成分析全过程。微流控忍片的基本结构是比较简单的， 就是在基板（通常是PDM巧上加工出微通道，然后将盖片和基片键合到一起，W形成封闭 的微流体通道。基于微流控忍片的循环肿瘤细胞富集检测方法是近年来出现的新技术，通 过将识别循环肿瘤细胞的抗体修饰在盖片的表面，并通过一定的几何设计使流过忍片的 细胞与负载抗体的表面有充分的接触，因此来确保循环肿瘤细胞能够被捕获，达到较高的 捕获效率。已报道的用于捕获循环肿瘤细胞的微流控忍片包括微柱阵列型忍片（化grath 5,61曰1.，化化'6 2007,450，1235)、具有交错式混合结构的"鱼骨型"忍片（51〇?8以 etal.Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A. 2010, 107, 18392;WangS.etal.Angew.Qiem.Int. Ed.2011，50,3084)、HTMSU忍片（AdamsAA，etal.J.Am.Chem.Soc.2008，130,8633)W及 Nano-Velcro忍片等。其中具有交错式混合结构的"鱼骨型"分离速度快，捕获率与富集纯 度均较高，富集到的循环肿瘤细胞的活性也高于其他常规技术，因此受到临床W及技术研 究领域的高度重视。 阳0化]"鱼骨型"忍片由具有交错式混合结构的PDMS基片与载玻片键合而成，其中PDMS基片中的交错式混合结构是一组经过设计的周期性的凹凸结构，用于打破微流体通道内的 层流，使其中的细胞能够与各壁面接触。传统的"鱼骨型"忍片存在两个缺点：（1)由于PDMS基片本身难W进行稳定的化学修饰，因此W往的"鱼骨型"忍片只将抗体负载于底部的载玻 片上，因此能够捕获循环肿瘤细胞的区域只设及微流体通道的底部；（2)载玻片上抗体的 负载有两种方法，一是将抗体直接修饰与载波片上，二是先将亲和素修饰与载玻片，待实验 是加入生物素标记的抗体，但无论是在载玻片上负载抗体还是亲和素都需要将"鱼骨型"忍 片低溫保存，且保质期一般只有几周。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种循环肿瘤细胞检测试剂盒及其制备方法和应用，用W解决目前 检测试剂盒捕获效率低、保质期短等问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述循环肿瘤细胞检测试剂盒，其 包括盒体、设置在盒体内的检测试剂和微流控忍片，所述微流控忍片由PDMS(聚二甲基娃 氧烧）基片和载玻片贴合构成，所述PDMS基片表面分布微通道，所述微通道底面设有"鱼骨 型"交错式混合结构；所述PDMS基片与载玻片键合后，微通道与载玻片表面形成微流体通 道，所述微通道表面负载有捕获探针。目前的微流控忍片中捕获探针均是负载在载玻片表 面，而微流体通道中微通道表面积比载玻片表面积大的多，上述鱼骨型结构不仅可有效打 破液体流动时的层流状态，从而使得细胞悬液有更多机会与微流体通道的各个壁面的多次 接触，增加细胞悬液通过时捕获的机率，而且增加了微流体通道的表面积，也就是增加了负 载捕获探针的表面积，通过计算模拟与实验证实样品从微流体通道内通过时，细胞与PDMS 基片上微通道表面接触的几率远远高于载玻片，因此将捕获探针负载在PDMS基片的微通 道表面可W大大提高稀有细胞的捕获效率。
[0008]进一步的，所述载玻片为聚赖氨酸修饰的载玻片。
[0009]进一步的，所述鱼骨型交错式混合结构中凹部宽度为125微米，凸部宽度为75微 米，凸起高度60微米，PDMS基片高度100微米。
[0010] 进一步的，所述检测试剂包括细胞识别探针、红细胞裂解液、清洗液、封闭液和染 色试剂。所述细胞识别探针可特异性结合循环肿瘤细胞，并且可与捕获探针特异性结合从 而被其捕获。
[0011] 进一步的，所述捕获探针为第一单链多核巧酸，所述细胞识别探针为抗体/第二 单链多核巧酸复合物，所述第二单链多核巧酸是与第一单链多核巧酸特异性结合，所述识 别抗体是与循环肿瘤细胞上具有识别性的抗原相应的抗体。
[0012] 单链多核巧酸是指20个W上核巧酸聚合成的单链化合物，所述第二单链多核巧 酸与第一单链多核巧酸特异性结合是指所述第二单链多核巧酸与第一单链多核巧酸有部 分互补，可实现特异性结合。
[0013]进一步的，所述识别抗体选自anti-EpCAM巧pCAM的抗体）、anti-EGFR(EGFR的抗 体）、anti-HER2 (肥R2的抗体）和anti-MUC-1 (MUC-1的抗体）中的一种W上。也就是说选 取的循环肿瘤细胞上具有识别效果的抗原选自化CAM、EGFR、肥R2和MUC-1中的一种W上。
[0014]进一步的，所述清洗液为皿SS(Hank'S平衡盐溶液），所述封闭液为lOwt%山羊血 清与3wt%牛血清白蛋白混合溶液。
[0015]进一步的，所述染色试剂为固定细胞染色试剂组和/或不固定细胞染色剂，所述 固定细胞染色试剂组包括固定细胞染色剂、固定液和透膜液。
[0016] 进一步的，所述固定液为4wt%多聚甲醒水溶液，所述透膜液为0.2wt%聚乙二醇 辛基苯基酸水溶液。 阳017] 进一步的，所述固定细胞染色剂包括巧光素标记的anti-CD45(CD45的抗体）、巧 光素标记的anti-CK(CK的抗体）和DAPI(4'，6-二脉基-2-苯基吗I噪），并且上述S种染色 剂的巧光显色各不相同。
[0018] 进一步的，所述不固定细胞染色剂包括巧光素标记的第一单链多核巧酸和巧光素 标记的anti-CD45,并且上述二种染色剂的巧光显色不相同。由于不固定细胞染色，不会对 后续的基因组扩增产生不利的影响，因此完成CTC检测后还可W进一步测序。
[0019] 本发明还提供了上述循环肿瘤细胞检测试剂盒中微流控忍片的制备方法，其包括 如下步骤：首先将PDMS基片浸泡在3-氨丙基=乙氧基硅烷水溶液中对微通道表面进行氨 基修饰，然后与载玻片进行键合，之后进一步进行微通道表面的捕获探针的负载。
[0020] 进一步的，所述捕获探针的负载方法如下：将氨基修饰的捕获探针与DMS0W体积 比3:2混合，混合液再与BS3〇3is(sulfosuccinimid5d)suberate)溶液W1:1体积比混合 后通入微流体通道，室溫下解育1.化；然后依次用0. 02wt%SDS(十二烷基硫酸钢）水溶液 和超纯水清洗，并用氮气吹干后即完成捕获探针的负载。
[0021] 本发明还提供了所述循环肿瘤细胞检测试剂盒在循环肿瘤细胞（CTC)检测中的 应用，其包括如下步骤：
[0022] 1)血液样本前处理：肿瘤患者的血液样本经红细胞裂解液裂解，重悬于清洗液中 W获得包含白细胞与循环肿瘤细胞的细胞悬液，然后与细胞识别探针解育，再通过离屯、除 去多余细胞识别探针，最后重悬于清洗液中W获得待检样本；
[0023] 2)循环肿瘤细胞捕获：将待检样本通入微流控忍片中，表面结合了细胞识别探针 的细胞与负载在微流体通道表面的捕获探针特异性结合，然后用清洗液清洗微流体通道W 除去非特异性吸附的细胞，从而完成对循环肿瘤细胞的捕获；
[0024] 3)