从细胞培养上清液和生物流体分离并纯化微泡的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。具体地，本发明提供从 细胞培养上清液和生物液体分离并纯化微泡的方法。本发明还提供微泡的药物组合物，其 用于促进或增强伤口愈合、刺激组织再生、改造疤痕组织、调节免疫反应、改变肿瘤细胞的 生长和/或可动性、或改变正常细胞的生长和/或可动性。本发明还提供欲用作诊断试剂 的微泡的组合物以及制备所述微泡的组合物的方法。
【背景技术】
[0002] 微泡是由许多（即使不是全部）体外和体内的细胞类型分泌的并且存在于诸如例 如血液、间质液、尿液、唾液和眼泪等生物流体中。微泡是由细胞的原生质膜形成的包含脂 质双层的囊泡并且在尺寸上是不均勾的，范围在约2nm至约5000nm。在本文中将形成微泡 的细胞称为"宿主细胞"。微泡是囊泡的异质群体并且包括例如外皮层、微粒、微泡、纳米囊 泡、脱落囊泡和膜颗粒。
[0003] 微泡在它们的膜表面显示出来自于它们的宿主细胞的膜蛋白质，并且还可以在微 泡中含有来自于所述宿主细胞的分子，诸如例如mRNA、miRNA、tRNA、RNA、DNA、脂质、蛋白质 或感染性颗粒。这些分子可以起因于或者是导入到所述宿主细胞中的重组分子。微泡在细 胞间通讯中发挥关键作用，并且可以在体内局部或远侧发挥作用，通过与靶细胞融合、将微 泡上和/或中的分子运输到所述靶细胞中而诱导细胞的改变。例如，微泡已经牵连到抗肿 瘤逆转、癌症、肿瘤免疫抑制、转移、肿瘤-基质相互作用、血管生成和组织再生。微泡还可 以用来诊断疾病，因为已经证明它们携带了多种疾病的生物标志物，包括例如心脏病、HIV 和白血病。
[0004] 尽管微泡较重要，但是以有用的量分离微泡并同时保存它们的结构和功能的完整 性仍然是个问题。传统的工序采用超速离心以从样本中分离微泡。
[0005] 例如，美国专利7, 807, 438公开了一种用于分离丙型肝炎病毒的方法。该方法包 含从感染了丙型肝炎病毒（HCV)的个体的血浆分离出称为外来体的颗粒并且从这些外来 体颗粒提取RNA。
[0006] 在另一个例子中，美国专利申请US20030198642A1公开了来源于抗原呈递细胞中 的富集了 MHC II类的隔室的[外]来体……[以用于]……接种赋形剂。
[0007] 在另一个例子中，美国专利申请US20060116321A1公开了用于在介导免疫抑制反 应中使用的方法和组合物。该组合物…包含具有免疫抑制活性的外来体。此种外来体可以 来源于各种不同的细胞类型，包括抗原呈递细胞，诸如树突状细胞和巨噬细胞。在分离外来 体之前，所述细胞可以经基因工程化以表达能够增强所述外来体的免疫抑制活性的分子和 /或暴露于一种或多种试剂（诸如细胞因子或细胞因子抑制剂），所述试剂也能够增强外来 体的免疫抑制活性。本发明还涉及此种外来体用于治疗与免疫系统的不希望的活化有关的 疾病和病症的用途。本发明还包括从血清中分离的已经证明具有免疫抑制性的外来体。
[0008] 超速离心可能损伤微泡，导致囊泡的裂解或破裂。如果将此种损伤的微泡导入到 体内的话，微泡的损伤可能在体内引发副反应。
[0009] 其他人已经尝试了替代方法以分离微泡。但是，所采用的所述替代方法经常分离 出微泡的子级分（sub-fraction)或效率低下。例如，美国专利申请US2011003008A1公开 了一种由骨髓间充质干细胞分泌的颗粒并且包含骨髓间充质干细胞的至少一种生物学性 质。所述生物学性质可以包含骨髓间充质干细胞条件培养基（MSC-CM)的生物活性，诸如心 脏保护或缩小梗死面积。所述颗粒可以包含囊泡或外来体。
[0010] 在另一个例子中，美国专利申请US20120070858A1公开了一种通过基于外来体 的预先确定Zeta电位的电荷吸引机制使用氧化铁（Fe 304)的超顺磁性纳米颗粒从血小板 分离外来体的方法。该方法涉及氧化铁纳米颗粒的使用，该氧化铁纳米颗粒是预先合成的 [sic (照抄原文）]、具有预先确定的正电荷并且结合到生物样品中含有的负电荷外来体。 在培育的过程中，所述阳离子磁性纳米颗粒由于静电相互作用而被外来体膜的表面吸收。 所述材料在磁场中的暴露使得能够分离结合至所述纳米颗粒的外来体。这种技术的成功已 经通过流式细胞仪[sic]对所述外来体的表征[sic]而得到了证实。该方法由于能够分离 并纯化外来体而不会改变它们的原始形态和结构特征，所以已经证明其适合于此目的。
[0011] 在另一个例子中，PCT专利申请W02012169970A1公开了连同对流层析、流化床或 共沉淀的应用而在生物材料（如抗体、病毒、细胞和细胞器）的纯化中使用约束共水化剂的 材料和方法。
[0012] 因此，仍然需要提供一种无损伤且以充足的量分离并纯化微泡的方法，所分离的 微泡随后可以用于诊断疾病、治疗或研究。
[0013] 本发明提供了用于从生物流体分离微泡的方法，其不会损伤所述微泡的结构和/ 或功能的完整性。本发明还提供用于从生物流体分离外皮层、微粒、微泡、纳米囊泡、脱落囊 泡、凋亡小体或膜颗粒的方法，其不会损伤它们的结构和/或功能的完整性。
【发明内容】
[0014] 在一个实施方式中，本发明提供一种从细胞培养上清液或生物流体分离和/或纯 化微泡的方法，其利用沉淀剂通过置换溶剂化的水而从所述细胞培养上清液或生物流体中 沉淀出所述微泡。
[0015] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂。在一个实施方式中，所述 分离的微泡的制剂随后被纯化。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以 产生外皮层的制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生微粒的 制剂。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生纳米囊泡的制剂。在 一个实施方式中，所这分离的微泡的制剂随后被纯化以产生脱落囊泡的制剂。在一个实施 方式中，所述分离的微泡的制剂随后被纯化以产生膜颗粒的制剂。在一个实施方式中，所述 分离的微泡的制剂随后被纯化以产生凋亡小体的制剂。
[0016] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强血管生成。 在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的血管生成。
[0017] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强神经元再 生。在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的神经元再生。
[0018] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强细胞增殖。 在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的细胞增殖。
[0019] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强细胞迀移。 在一个实施方式中，所述分离的微泡的制剂促进或增强患者中的细胞迀移。
[0020] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其促进或增强伤口愈合。 在一个实施方式中，所述伤口为三度烧伤。在一个实施方式中，所述伤口是二度烧伤。
[0021 ] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其减少患者中的疤痕形 成。
[0022] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其减少患者皮肤中的皱 纹形成。
[0023] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其用于在患者中诊断疾 病的存在和/或进展。在一个实施方式中，所述疾病是转移性黑色素瘤。在替代的实施方 式中，所述疾病是炎症/自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎。在一个实施方式中，所述 疾病是移植物抗宿主病。
[0024] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其可以促进复杂组织结 构的功能再生与组织机化。在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其可以 在患有再生障碍性贫血的患者中再生造血组织。在一个实施方式中，本发明提供一种分离 的微泡的制剂，其可以在具有患病、损伤或丢失的皮肤的患者中再生选自于由上皮组织、间 质组织、神经组织、血管组织和附属结构组成的组中的至少一种组织。在一个实施方式中， 本发明提供一种分离的微泡的制剂，其可以再生来自于所有三种胚层的组织和/或细胞。
[0025] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其用于调节患者的免疫 系统。
[0026] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其增强了移植到患者中 的组织或细胞的成活率。在一个实施方式中，在患者接受移植的组织或细胞之前，使用所述 分离的微泡的制剂治疗患者。在替代的实施方式中，在患者接受所述移植的组织或细胞之 后，使用所述分离的微泡的制剂治疗患者。在替代的实施方式中，使用所述分离的微泡的制 剂治疗所述组织或细胞。在一个实施方式中，在移植之前使用所述分离的微泡的制剂治疗 所述组织或细胞。
[0027] 在一个实施方式中，本发明提供一种分离的微泡的制剂，其含有选自于由来自于 宿主细胞的RNA、DNA和蛋白质组成的组中的至少一种分子。在一个实施方式中，所述宿主 细胞经工程化以表达选自于由RNA、DNA和蛋白质组成的组中的至少一种分子。在一个实施 方式中，将含有选自于由来自宿主细胞的RNA、DNA和蛋白质组成的组中的至少一种分子的 所述分离的微泡的制剂用作治疗剂。
【附图说明】
[0028] 并入到本文并且构成本说明书一部分的附图阐述了本发明的各种实施方式，并且 与描述一起进一步用于解释本发明的原理并且使得本领域普通技术人员能够制造和使用 本发明。在附图中，相同的参考数字指示相同或功能相似的元素。本发明的更完全的理解 及其许多伴随的优点将容易获得，因为在连同考虑所述附图并参见以下说明说明时能够使 它们变得更好理解，其中：
[0029] 图1示出了用于通过超速离心分离微泡的试验记录示意图。
[0030] 图2示出了本发明的微泡分离方法的一个实施方式。
[0031]图3示出了本发明的微泡分离方法的替代实施方式。
[0032] 图4示出了通过过滤促进生物流体的澄清和析出的微泡的收集的装置的一个实 施方式。
[0033] 图5示出了通过实施例1中所描述的超速离心法分离的（图A和B)和根据本 发明的方法分离的（图C和D)来源于使用人类骨来髓源的间充质干细胞条件培养的 (conditioned)培养基的微泡的电子显微照片，放大倍数如图中所示。
[0034] 图6示出了通过实施例1中所描述的超速离心法分离的（面板A和B)和根据本 发明的方法分离的（图C和D)来源于使用猪骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基 的微泡的电子显微照片，放大倍数如图中所示。
[0035] 图7示出了通过实施例1中所描述的超速离心法分离的（图A和B)和根据本发 明的方法分离的（图C和D)来源于使用小鼠骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基 的微泡的电子显微照片，放大倍数如图中所示。
[0036] 图8示出了根据本发明的方法从人类血浆分离的微泡的电子显微照片。图A至C 示出了在增加放大倍数下的微泡，如图中的比例尺所示。
[0037] 图9示出了根据本发明的方法从猪血浆分离的微泡的电子显微照片。图A至C示 出了在增加放大倍数下的微泡，如图中的比例尺所示。
[0038] 图10示出了根据本发明的方法从人尿液分离的微泡的电子显微照片。图A至C 示出了在增加放大倍数下的微泡，如图中的比例尺所示的。
[0039] 图11示出了免疫印迹，其报告了 HSP70、CD63、STAT 3和磷酸化的STAT3在人类骨 髓来源的间充质干细胞的裂解物中、通过超速离心（hMSC MV超速离心）或通过如实施例3 中所描述的本发明的方法（hMSC PEG沉淀）制备的从使用人类骨髓来源的干细胞条件培养 的培养基分离的微泡中的表达。还分析了来源于通过如实施例3中所述的本发明的方法制 备的人血浆和人尿液的微泡。分别为（人血浆PEG沉淀）和（人尿液PEG沉淀）。
[0040] 图12示出了从使用人类骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡 对正常人真皮成纤维细胞（A)、从糖尿病足溃疡获得的真皮成纤维细胞（B)和从压力足部 溃疡获得的真皮成纤维细胞（C)的增殖的影响。还比较了通过超速离心分离的微泡（MV U/ C)和通过本发明的方法分离的微泡（MV PEG)的影响。将使用PBS或微泡耗尽的培养基处 理的成纤维细胞纳入作为对照。使用MTT测定法确定增殖。
[0041]图13示出了从使用人类骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡 对人真皮成纤维细胞的迀移的影响，其通过成纤维细胞迀移至已被刮掉的区域中的能力来 确定。标记了 "处理前"的图示出了在添加测试处理前的除去了细胞的细胞培养板的代表 性区域。以所示的浓度使用根据本发明的方法分离的微泡（PEG沉淀）和通过超速离心分 离的微泡（超速离心）测试成纤维细胞迀移的影响。将使用PBS或微泡耗尽的培养基处理 的成纤维细胞纳入作为对照。
[0042]图14示出了从使用人类骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡 对从糖尿病足溃疡获得的人真皮成纤维细胞的迀移的影响，其通过成纤维细胞迀移至已被 刮掉的区域中的能力来确定。标记了"处理前"的图示出了在添加测试处理前的除去了细 胞的细胞培养板的代表性区域。以所示的浓度使用根据本发明的方法分离的微泡（PEG沉 淀）和通过超速离心分离的微泡（超速离心）测试成纤维细胞迀移的影响。将使用PBS或 微泡耗尽的培养基处理的成纤维细胞纳入作为对照。
[0043]图15示出了本发明的微泡向人真皮成纤维细胞中的摄入。在标记了 "Hoechst33342"的图中示出了使用Hoechst 33342染料解析的细胞核。在标记了 "Vybrant-Dio"的图中示出了使用vybrant染料解析的细胞。在标记了"PKH标记的MV"的 图中示出了使用PKH染料解析的微泡。在标记了 "复合"的图中可以看到其中重叠所有三 种染料获得的图像的图。
[0044]图16示出了本发明的微泡向人真皮成纤维细胞中的摄入。在标记了 "Hoechst33342"的图中示出了使用Hoechst 33342染料解析的细胞核。在标记了 "Vybrant-Dio"的图中示出了使用vybrant染料解析的细胞。在标记了"PKH标记的MV"的 图中示出了使用PKH染料解析的微泡。在标记了 "复合"的图中可以看到其中重叠所有三 种染料获得的图像的图。
[0045] 图17示出了使用如下物质处理的人真皮成纤维细胞的裂解物的免疫印迹：根据 本发明的方法从获自于患有类风湿性关节炎的患者的血浆分离的微泡（人血浆MV PEG沉 淀）；根据本发明的方法从使用骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡 (人类hMSC MV PEG沉淀）；通过超速离心从使用骨髓来源的间充质干细胞分离的微泡（人 hMSC MV超速离心）；PBS对照；和耗尽的培养基对照（耗尽了 MV的hMSC条件培养的培养 基）。
[0046] 图18示出了含有包含T1799A突变的BRAF的外显子15的区域的存在，其中： SK-MEL28细胞，使用引物1从RNA扩增（第3道）；SK-MEL28细胞，使用引物2从RNA扩增 (第4道）；根据本发明的方法从使用SK-MEL28细胞条件培养的培养基分离的微泡，使用引 物1从RNA扩增（第5道）；根据本发明的方法从使用SK-MEL28细胞条件培养的培养基分 离微泡，使用引物2从RNA扩增（第6道）；SK-MEL28细胞，使用引物1从DNA扩增（第7 道）；SK-MEL28细胞，使用引物2从DNA扩增（第8道）；根据本发明的方法从使用SK-MEL28 细胞分离的微泡，使用引物1从DNA扩增（第9道）；和根据本发明的方法从使用SK-MEL28 细胞条件培养的培养基分离的微泡，使用引物2从DNA扩增（第10道）。
[0047] 图19示出了 V600E BRAF在SK-MEL28细胞的裂解物和根据本发明的方法从使用 SK-MEL28细胞条件培养的培养基分离的微泡的裂解物中的存在。
[0048] 图20示出了根据本发明的方法从使用获自于表达绿色荧光蛋白（GFP)的小鼠 的骨髓来源的干细胞条件培养的培养基分离的微泡向人真皮成纤维细胞中的摄入。标 记了"Hoechst33342"的图中示出了使用Hoechst 33342染料解析的细胞核。标记了 "Vybrant-Dio"的图中示出了使用vybrant染料解析的细胞。标记了 "GFP"的图中示出了 GFP-标记的微泡。在标记了 "复合"的图中可以看到其中重叠所有三种染料获得的图像的 图。
[0049] 图21示出了根据本发明的方法从使用获自于表达GFP的小鼠的骨髓来源的干细 胞条件培养的培养基分离的微泡向人真皮成纤维细胞中的摄入。标记了 "H〇eChst33342" 的图中示出了使用Hoechst 33342染料解析的细胞核。标记了"Vybrant-Dio"的图中示出 了使用vybrant染料解析的细胞。标记了 "GFP "的图中示出了 GFP-标记的微泡。在标记 了"复合"的图中可以看到其中重叠所有三种染料获得的图像的图。
[0050] 图22示出了来自以下的伤后5天的全层伤口的组织切片：(A)未处理的动物；(B) 根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡； (C)盐水；和（D)通过超速离心从自体骨髓来源的间充质干细胞分离的微泡。
[0051] 图23示出了伤后7天的用如下物质处理的动物上的二度烧伤的图片，所述物质 是：(A)通过超速离心从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微 泡；(B)根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的 微泡；和（C)未处理的动物。（D)示出了受伤7天后的使用通过超速离心从使用自体骨髓 来源的间充质干细胞条件培养的培养基分离的微泡处理的动物中的全层伤口。箭头指示使 用通过超速离心分离的微泡处理的全层伤口在第7天的脓肿形成（40X)。这未在使用根据 本发明的方法制备的微泡处理的全层伤口中观察到。
[0052] 图24示出了来自使用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条 件培养的培养基分离的微泡处理的动物伤后28天的二度伤口的组织玻片。
[0053] 图25示出了来自使用盐水处理的动物伤后28天的二度伤口的组织玻片。
[0054] 图26示出了来自使用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条 件培养的培养基分离的微泡处理的动物伤后28天的全层伤口的组织玻片。
[0055] 图27示出了来自使用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条 件培养的培养基分离的微泡处理的动物伤后28天的全层伤口的组织玻片。A示出了新神经 生长（箭头）和血管生成（圈）。B示出了新神经生长（箭头）