微泡在医学疾病和病况的诊断、预后和治疗中的用图
【专利说明】微泡在医学疾病和病况的诊断、预后和治疗中的用途
[0001] 相关申请 本申请要求于2012年10月3日提交的美国申请号61/709, 337的优先权和权益；其全 部内容通过引用结合到本文中。
[0002] 发明背景 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶BRAF，RAS癌基因沿MEK/ERK信号转导途径上的一种下游 效应物，已经成为用于人类癌症的诊断、预后和治疗指导的重要生物学标记。突变的BRAF V600E的高度流行意味着该突变在这些癌症亚类的发展中是重要的"驱动剂"或"共驱动 剂"。此外，具有BRAF突变的癌症通常比其无突变的相对物而言更具攻击性。因此，突变的 BRAF已经成为用于精确癌症治疗的极具吸引力的靶标。因此，用于诊断、预后和治疗指导的 BRAF的检测在临床应用上变得越来越重要。
[0003] 检测癌症突变谱、例如BRAF突变的现有技术，包括活检样品的分析和在体液例如 血液中循环的突变肿瘤DNA片段的非侵袭性分析（Diehl等人，2008)。前一种方法是侵 袭性的、复杂的并可能对受试者有害。此外，在侵入性活检程序中，组织样品采自有限的 区域，并因此，可能给出假阳性或假阴性，尤其在不均匀的和/或分散在正常组织中的肿瘤 中。后一种方法因体液中的突变的癌DNA拷贝数极低而固有地缺乏灵敏度（Gormally等 人，2007)。因此，非常需要用于检测BRAF突变的非侵入性和灵敏的诊断方法。
[0004] 发明概述 本发明解决了用于检测BRAF突变的非侵入性和高度准确的诊断方法的需求。一般而 言，本发明特征在于在分离自生物样品的微泡的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的方法。
[0005] 本发明特征在于在受试者中诊断疾病或其它医学病况的方法，包括自所述受试者 的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中 检测BRAF突变的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示 所述受试者中的疾病或其它医学病况的存在或所述受试者发展疾病或其它医学病况的更 高倾向。
[0006] 本发明特征在于确定用于治疗患有疾病或其它医学病况的受试者的治疗方案的 方法，包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提 取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的 BRAF突变的存在指示使用包含至少一种激酶抑制剂的治疗方案。在某些实施方案中，所述 激酶抑制剂是RAF抑制剂或MEK抑制剂。在某些实施方案中，所述RAF抑制剂是BRAF-特 异性抑制剂。在一些优选的实施方案中，所述治疗方案包含靶向突变的BRAF或来自突变的 BRAF的下游信号转导的药物。例如，所述治疗方案包含威罗菲尼（vemurafenib)或达拉非 尼（dabrafenib)。本发明特征在于这样的方法，其中所述疾病或其它医学病况是癌症。在 某些实施方案中，所述癌症是黑素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳癌、脑癌、胰腺癌、肺 癌、淋巴瘤或白血病。
[0007] 本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变是活化突变。
[0008] 本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变编码突变的BRAF多肽，其中所述 突变的BRAF多肽是V600E。
[0009] 本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变是T1799A。
[0010] 本发明特征在于这样的方法，其中所述生物样品是体液样品。在一些方面，所述 体液样品是血浆、血清、脑脊液或腹水液。在其他优选的实施方案中，所述体液样品是支气 管肺泡灌洗液（BAL)和囊肿液。在一些方面，所述体液样品在以下范围内：1-25ml，例如， 2-25ml、2-20ml、2-15ml、2-10ml、4-25ml、4-20ml、4-15ml、4-10ml、6-25ml、 6-20 ml、6_15ml、6_10ml、8_25ml、8_20ml、8_15ml、10_25ml、10_20ml、10_15ml、15_25ml 或 15-20ml〇
[0011] 现在将详细描述本发明的各方面和实施方案。可以理解，可以对细节进行修改，而 不偏离本发明的范围。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语将包括复数，复数术语将 包括单数。
[0012] 所确定的所有专利、专利申请和出版物都通过引用明确地结合到本文中，用于描 述和公开例如在这些出版物中描述的方法学的目的，所述方法学可用于本发明。提供这些 出版物仅为其先于本申请申请日的公开内容。在这一点上不应视为承认本发明人由于在先 发明或任何其他原因而无权享有先于这样的公开内容。对日期的所有声明或对这些文件内 容的表现都基于申请人可得的信息而不构成对这些文件的日期或内容的准确性的任何承 认。
[0013] 附图简述 图1是样品081 (深灰色）和055 (浅灰色）的实时PCR数据的图示。扩增曲线代表 对自样品081提取的DNA的一式三份的QPCR测定。根据来自肿瘤组织的活检数据，在样品 081中检测到BRAF突变（V600E)，但在样品055中未检测到。ARn代表归一化到参考荧光 信号和基线焚光的报告信号；log(ARn)对PCR循环数作图。
[0014] 图2是对于自样品MGHSS04提取的RNA的实时PCR数据的图示。根据来自肿瘤组 织的活检数据，检测BRAF突变。ARn代表归一化到参考荧光信号和基线荧光的报告信号； log(ARn)对PCR循环数作图。
[0015] 图3是对于自样品091提取的RNA的实时PCR数据的图示。根据来自肿瘤组织的 活检数据，在样品091中检测到无突变。Rn代表归一化到参考荧光信号和基线荧光的报告 信号；log(ARn)对PCR循环数作图。
[0016] 发明详述 微泡由真核细胞脱落，或从质膜中出芽，到细胞外面。这些膜囊泡的尺寸是不均匀的， 其直径范围为约l〇nm至约5000nm。由细胞内多泡体胞吐释放的小微泡（直径为约10至 lOOOnm，更经常为约30至200nm)在本领域中称为"外来体（exosome)"。本文描述的方法 和组合物同样适用于所有尺寸，优选30至800nm的微泡。
[0017] 在一些文献中，术语"外来体"也指含有参与mRNA降解和核仁小RNA(snoRNA)、 核内小RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)加工的核糖核酸外切酶的蛋白质复合体（Liu等 人，2006b;vanDijk等人，2007)。此类蛋白质复合体没有膜，并且不是本文使用的那些 术语，"微泡"或"外来体"。
[0018] 近来，研究已经揭示出微泡内的核酸具有作为生物标志物的作用。使用自微泡中 提取的核酸被认为有可能免除对活检的需求，突出显示出微泡生物学的巨大的诊断潜力 (Skog等人，2008)。本文所述的方法特征在于自微泡中提取的核酸用于检测BRAF突变的 用途，用于诊断、预测受试者中的疾病或医学病况的存在，或用于评价或确定患有疾病或医 学病况的受试者的治疗方案。
[0019] BRAF RAF激酶是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它们是促分裂原-活化蛋白（MAP)激酶途 径的关键组分，该途径是信号转导途径，在基因表达、细胞生长、增殖、分化和程序性细胞死 亡的调节中起到根本性作用。MAP激酶途径在真核生物中是保守的，其功能是经由受体和磷 酸化级联而转导胞外信号到细胞核，用于活化转录因子；所述胞外信号例如激素、细胞因子 和各种生长因子。信号转导途径是通过胞外促分裂原信号所致的受体酪氨酸激酶的活化而 启动。受体酪氨酸激酶活化Ras，一种GTP酶，其导致膜募集和RAF蛋白的活化。RAF的活 化继而导致磷酸化和随后的蛋白激酶MEK的活化。MEK然后使ERK磷酸化，这可直接和间接 活化转录因子，导致参与细胞增殖和生存的多种调苄基因的表达。
[0020] BRAF，也称为v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl、B-RAF、BRAF1、B-RAF1、NS7和 RAFB1，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的RAF家族成员。该家族由3种高度保守的激酶组成： ARAF(或A-RAF)、CRAF(RAF-1或C-RAF)和BRAF。如本文使用的，"BRAF"包括所有已知 的人类BRAF同源物和变体，以及与BRAF具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同源 性的其它核酸和多肽。在某些实施方案中，BRAF被鉴定为包含Genbank检索号NM_004333 (SEQIDNO: 1)所示的核酸序列，其中起始密码子和终止密码子以斜体和下划线表示，导致 在氨基酸600的突变的共同致癌突变以下划线和黑体表示： CGCCTCCCTTCCCCCTCCCCGCCCGACAGCGGCCGCTCGGGCCCCGGCTCTCGGTTATAAG^r^GCGGCGCT GAGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCGCGGAGCCGGGCCAGGCTCTGTTCAACGGGGACATGGAGCCCGAGGCCGGCGCCG GCGCCGGCGCCGCGGCCTCTTCGGCTGCGGACCCTGCCATTCCGGAGGAGGTGTGGAATATCAAACAAATGATTAAG TTGACACAGGAACATATAGAGGCCCTATTGGACAAATTTGGTGGGGAGCATAATCCACCATCAATATATCTGGAGGC CTATGAAGAATACACCAGCAAGCTAGATGCACTCCAACAAAGAGAACAACAGTTATTGGAATCTCTGGGGAACGGAA CTGATTTTTCTGTTTCTAGCTCTGCATCAATGGATACCGTTACATCTTCTTCCTCTTCTAGCCTTTCAGTGCTACCT TCATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCACAAAAACCTATCGTTAG AGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGGAGTTACAGTCCGAGACAGTCTAAAGAAAG CACTGATGATGAGAGGTCTAATCCCAGAGTGCTGTGCTGTTTACAGAATTCAGGATGGAGAGAAGAAACCAATTGGT TGGGACACTGATATTTCCTGGCTTACTGGAGAAGAATTGCATGTGGAAGTGTTGGAGAATGTTCCACTTACAACACA CAACTTTGTACGAAAAACGTTTTTCACCTTAGCATTTTGTGACTTTTGTCGAAAGCTGCTTTTCCAGGGTTTCCGCT GTCAAACATGTGGTTATAAATTTCACCAGCGTTGTAGTACAGAAGTTCCACTGATGTGTGTTAATTATGACCAACTT GATTTGCTGTTTGTCTCCAAGTTCTTTGAACACCACCCAATACCACAGGAAGAGGCGTCCTTAGCAGAGACTGCCCT AACATCTGGATCATCCCCTTCCGCACCCGCCTCGGACTCTATTGGGCCCCAAATTCTCACCAGTCCGTCTCCTTCAA AATCCATTCCAATTCCACAGCCCTTCCGACCAGCAGATGAAGATCATCGAAATCAATTTGGGCAACGAGACCGATCC TCATCAGCTCCCAATGTGCATATAAACACAATAGAACCTGTCAATATTGATGACTTGATTAGAGACCAAGGATTTCG TGGTGATGGAGGATCAACCACAGGTTTGTCTGCTACCCCCCCTGCCTCATTACCTGGCTCACTAACTAACGTGAAAG CCTTACAGAAATCTCCAGGACCTCAGCGAGAAAGGAAGTCATCTTCATCCTCAGAAGACAGGAATCGAATGAAAACA CTTGGTAGACGGGACTCGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACAAAGAATTGGATCTGG ATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTGATGTG