和分析 之间经过的时期，将取决于受试者的情况，并且由技术人员来确定。当分析来自受试者经历 的治疗相关基因的核酸时，这样的方法将证明极大的益处。例如，可以监测治疗所靶向基因 的突变的发展（使其抵抗治疗），在这时，可因此改进治疗。监测的基因也可以是指示针对 特定治疗的特定反应性的基因。
[0067] 本发明的方面也涉及以下事实：各种非癌疾病和/或医学病况也具有遗传关联和 /或原因，并且所述疾病和/或医学病况可以同样通过本文所述的方法来诊断和/或监测。 许多这样的疾病本质上是代谢疾病、感染性疾病或变性疾病。
[0068] 技术人员根据各种因素的一种或多种的分析，选择从中分离微泡的个体。这些所 考虑的因素是受试者是否具有特定疾病（例如癌症）的家族病史，具有所述疾病的遗传倾 向，因家族史而具有所述疾病的增加的风险，遗传倾向，指示倾向的其它疾病或体征、或环 境原因。环境原因包括生活方式、接触引起或促进疾病的试剂，例如在空气、土壤、水或饮食 中。另外，先前患有所述疾病，目前诊断患有所述疾病（在治疗前或治疗后），目前正在治疗 所述疾病（经历治疗），从所述疾病中缓解或恢复，这些都是选择个体进行所述方法的其它 原因。
[0069] 本文所述的方法任选与额外步骤一起进行，所述额外步骤是在分析步骤前选择基 因或核酸用于分析。该选择可基于受试者的任何倾向，或任何先前的暴露或诊断，或受试者 所经历的或目前进行的治疗性治疗。
[0070] 所诊断、监测或另外进行谱分析（profile)的癌症可以是任何类型的癌症。其包 括但不限于：上皮细胞癌，例如肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳癌、脑癌、结肠癌和前 列腺癌。也包括的是胃肠癌、头颈部癌、非小细胞肺癌、神经系统的癌症、肾癌、视网膜癌、皮 肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖泌尿癌和膀胱癌、黑素瘤和白血病。另外，本发明的方法和组合物 同样可用于个体的非恶性肿瘤（例如纤维神经瘤、脑膜瘤和许旺氏细胞瘤（schwannoma)) 的检测、诊断和预后。优选地，所述癌症与BRAF的致癌的或活化的突变有关。
[0071] 应当理解，本发明不限于本文所述的具体的方法学、方案和试剂，因此可变化。本 文所用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的，而无意限制仅由权利要求书限定的本发 明范围。 实施例
[0072] 实施例1:自微泡制备核酸 本发明提供自患者样品分离的微泡中提取核酸的方法。具体地讲，DNA和RNA提取自 黑素瘤患者的血浆样品。在提取前，样品经过预处理。例如，将2-20ml范围内的血浆样品 在超速离心机中以120, 000xg离心80分钟。任选地，将RNA酶抑制剂、例如RNasinPlus (40u/yl，Promega)或Superasin(20u/yl，Ambion)，加入到沉淀物中并在室温下孵 育5分钟。含微泡的沉淀物再经处理，使用制造商推荐方案，用QiagenDNeasyBloodand TissueKit(目录号 69504)进行DNA提取，或用QiagenmiRNeasyKit(目录号 217004) 进行RNA提取。
[0073] 在某些实施方案中，在分析前将提取的RNA逆转录为cDNA可能是优选的。用市售 的cDNA合成试剂盒进行RNA逆转录，所述试剂盒含有逆转录酶，例如Superscript?VIL0? (Invitrogen)。逆转录反应如下进行：
然后在热循环仪例如VeritiPCR机器上进行cDNA合成反应。cDNA反应程序如下： 1. 25〇C10min 2. 42°C70min 3. 85〇C5min 4. 4°C 然后将cDNA在-20°C或_80°C冷冻，用于长期贮存。
[0074] 实施例2:用QPCR方法检测BRAF突夺 使用本文公开的方法分析来自黑素瘤患者的血浆样品。原始肿瘤的活检同时在样品 081和MGHSS04中显示V600EBRAF突变。样品055和091来自V600EBRAF突变阴性的黑 素瘤患者。
[0075] 首先，微泡部分得自血浆，使用本文公开的方法自微泡中提取DNA或RNA。对于 QPCR测定，用以下QPCR引物和探针分析5y1提取的DNA或2y1cDNA: BRAFWT正向：AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT(SEQIDNO: 3) BRAFMTARMS正向：AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA(SEQIDNO: 4) BRAFJSE15 反向：TGGATCCAGACAACTGTTCAA(SEQIDNO: 5) BRAFAZE15 探针（VIC-MGB):GATGGAGTGGGTCCCATCAG(SEQIDNO: 6) 使用TaqmanGenExpressionMasterMix(AppliedBiosystems4369016)准备QPCR反应如下：
使用的扩增程序如下： 1. 50°C 2 分钟 2. 95°C 10 分钟 3. 95°C 15 秒钟 4. 60°C 60 秒钟 5. 重复步骤3和4,总共50个循环 通过QPCR，一式三份地分析每个样品。对于样品081，Ct值是34. 7、34. 79和36. 89。 对于样品MGHSS04,Ct值是35. 28、34. 69和35. 21。扩增阈值经手动设置在基线上。样品 055和081的扩增图见图1。样品MGHSS04的扩增图见图2。样品091的扩增图见图3。
[0076] 如图1、2和3所示，根据来自肿瘤组织的活检数据，BRAF的突变形式在样品081和 样品MGHSS04中检出，正如所料。因此，BRAF的突变形式在样品055或样品091中未检出， 正如所料。这些结果证明，通过QPCR测定，自生物样品提取的核酸中可以准确和可重复地 检测突变的BRAF。
[0077]实施例3:伸用DNA和RNA分析以提高检测灵敏度 通过QPCR分析一组黑素瘤患者的BRAF突变状态。通过活检分析，所有患者的BRAF突 变呈阳性。具体地讲，来自患者051、057、061、074、085、089、090、098、107和109的活检样 品含有V600EBRAF突变。来自患者062的活检样品表现出V600KBRAF突变。
[0078] 通过本文公开的方法，自该组黑素瘤患者的血浆和血清样品中提取DNA和RNA。核 酸经过QPCR分析，以检测BRAF突变。QPCR分析的结果概述于表1。对于所有样品，对DNA 或RNA的分析得到BRAF突变的存在情况的准确检测。对于一些样品，对这两者的检测允许 提高BRAF突变检测的灵敏度，并且显示自微泡提取的核酸中检测BRAF对于癌症的诊断和 预后而言可以是有价值的。
[0079] 表1.自一组黑素瘤患者的DNA和RNA样品的QPCR分析的结果概述。
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