GCAGTGAAAATGTTGAATGTGACAGCACCTACAC CTCAGCAGTTACAAGCCTTCAAAAATGAAGTAGGAGTACTCAGGAAAACACGACATGTGAATATCCTACTCTTCATG GGCTATTCCACAAAGCCACAACTGGCTATTGTTACCCAGTGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGTATCACCATCTCCATAT CATTGAGACCAAATTTGAGATGATCAAACTTATAGATATTGCACGACAGACTGCACAGGGCATGGATTACTTACACG CCAAGTCAATCATCCACAGAGACCTCAAGAGTAATAATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGAT TTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGAT GGCACCAGAAGTCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGCATTTGGAATTGTTC TGTATGAATTGATGACTGGACAGTTACCTTATTCAAACATCAACAACAGGGACCAGATAATTTTTATGGTGGGACGA GGATACCTGTCTCCAGATCTCAGTAAGGTACGGAGTAACTGTCCAAAAGCCATGAAGAGATTAATGGCAGAGTGCCT CAAAAAGAAAAGAGATGAGAGACCACTCTTTCCCCAAATTCTCGCCTCTATTGAGCTGCTGGCCCGCTCATTGCCAA AAATTCACCGCAGTGCATCAGAACCCTCCTTGAATCGGGCTGGTTTCCAAACAGAGGATTTTAGTCTATATGCTTGT GCTTCTCCAAAAACACCCATCCAGGCAGGGGGATATGGTGCGTTTCCTGTCCACrg^AACAAATGAGTGAGAGAGTT CAGGAGAGTAGCAACAAAAGGAAAATAAATGAACATATGTTTGCTTATATGTTAAATTGAATAAAATACTCTCTTTT TTTTTAAGGTGAACCAAAGAACACTTGTGTGGTTAAAGACTAGATATAATTTTTCCCCAAACTAAAATTTATACTT AACATTGGATTTTTAACATCCAAGGGTTAAAATACATAGACATTGCTAAAAATTGGCAGAGCCTCTTCTAGAGGCTT TACTTTCTGTTCCGGGTTTGTATCATTCACTTGGTTATTTTAAGTAGTAAACTTCAGTTTCTCATGCAACTTTTGTT GCCAGCTATCACATGTCCACTAGGGACTCCAGAAGAAGACCCTACCTATGCCTGTGTTTGCAGGTGAGAAGTTGGCA GTCGGTTAGCCTGGGTTAGATAAGGCAAACTGAACAGATCTAATTTAGGAAGTCAGTAGAATTTAATAATTCTATTA TTATTCTTAATAATTTTTCTATAACTATTTCTTTTTATAACAATTTGGAAAATGTGGATGTCTTTTATTTCCTTGAA GCAATAAACTAAGTTTCTTTTTATAAAAA 在其它实施方案中，BRAF被鉴定为具有Genbank检索号NP_004324(SEQIDN0:2)的 序列的多肽，其中在氨基酸600的致癌突变以下划线和黑体表示： MAALSGGGGGGAEPGQALFNGDMEPEAGAGAGAAASSAADPAIPEEVWNIKQMIKLTQEHIEALLDKFGG EHNPPSIYLEAYEEYTSKLDALQQREQQLLESLGNGTDFSVSSSASMDTVTSSSSSSLSVLPSSLSVFQNPTDVA RSNPKSPQKPIVRVFLPNKQRTVVPARCGVTVRDSLKKALMMRGLIPECCAVYRIQDGEKKPIGffDTDISffLTGE ELHVEVLENVPLTTHNFVRKTFFTLAFCDFCRKLLFQGFRCQTCGYKFHQRCSTEVPLMCVNYDQLDLLFVSKFF EHHPIPQEEASLAETALTSGSSPSAPASDSIGPQILTSPSPSKSIPIPQPFRPADEDHRNQFGQRDRSSSAPNVH INTIEPVNIDDLIRDQGFRGDGGSTTGLSATPPASLPGSLTNVKALQKSPGPQRERKSSSSSEDRNRMKTLGRRD SSDDWEIPDGQITVGQRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKMLNVTAPTPQQLQAFKNEVGVLRKTRHVNILLFMGYS TKPQLAIVTQWCEGSSLYHHLHIIETKFEMIKLIDIARQTAQGMDYLHAKSIIHRDLKSNNIFLHEDLTVKIGD FGLATVKSRffSGSHQFEQLSGSILffMAPEVIRMQDKNPYSFQSDVYAFGIVLYELMTGQLPYSNINNRDQIIFM VGRGYLSPDLSKVRSNCPKAMKRLMAECLKKKRDERPLFPQILASIELLARSLPKIHRSASEPSLNRAGFQTEDF SLYACASPKTPIQAGGYGAFPVH BRAF激酶包含Ras-结合结构域和蛋白激酶结构域。BRAF激酶结构域具有特征性的双 叶形构造，N-末端小叶（N-叶）和C-末端大叶（C-叶）被催化性裂缝（catalyticcleft) 分隔开。N-叶含有富含甘氨酸的ATP-磷酸结合环（P-环），其锚定和定向ATP，这对激酶 活性是至关重要的。在无活性构象时，催化性裂缝难以接近，然而一旦被Ras活化后，该激 酶经过构象变化，使催化性裂缝可接近，BRAF具有活性。活化BRAF通过MEK转导信号以活 化ERK，其继而又活化下游转录因子，诱发一系列生化过程，包括细胞分化、增殖、生长和细 胞凋亡。
[0021] BRAF突夺和癌症 据估计在所有癌症的30%中，MAPK途径中是突变的，且BRAF基因突变存在于所有癌症 的约7%中（Garnett等人，2004，Davies等人，2002)。重要的是，已经发现BRAF在宽范 围的癌症中是突变的，包括40-70%恶性黑素瘤（其是第六最常见的癌症），45%乳头状甲状 腺癌，10%结直肠癌，并且也已经在卵巢癌、乳癌和肺癌、和淋巴瘤和白血病中鉴定。
[0022] BRAF的活化突变首先由Sanger研究院于2002年描述（Davies等人，2002)。目 前，在BRAF基因中已经鉴定出与人类癌症相关的约40种不同突变。最常见的BRAF突变是 在位置1799 (以前称为1796位置）的从胸腺嘧啶到腺嘌呤的单碱基改变，其突出显示在 SEQIDN0:1中，导致在氨基酸序列的位置600的谷氨酸（E)取代缬氨酸（V)(以前称为599 位置），其突出显示在SEQIDN0:2中。根据癌症的体细胞突变目录（CatalogueofSomatic MutationsinCancer，C0S-MIC)数据库，该突变目前占所有BRAF突变的多达97%。癌症相 关突变已经主要在激酶结构域中鉴定。
[0023] 本发明公开了用于确定BRAF核酸中的一个或多个突变的存在或不存在的方法。 优选地，所述突变是活化突变或致癌突变。优选地，所述突变是取代。所述突变也可以是 BRAF核酸的一个或多个取代、插入、缺失或重排或其组合。在某些实施方案中，所述突变是 在BRAF核酸的位置1799的取代突变。优选地，所述突变是在BRAF核酸序列的位置1799 的单碱基改变或错义突变，其中T突变为A。
[0024] 在本发明的一些实施方案中，BRAF核酸的突变编码突变的BRAF多肽。优选地，所 述突变的BRAF多肽是V600E(也称为V599E)。本发明其它优选的突变的BRAF多肽包括： V600K、V600D和V600R。在其它实施方案中，所述突变的BRAF多肽可以额外地包括以下氨 基酸位置上的突变：439、440、443、444、453、456、459、460、462、464、466、467、468、469、471、 472、475、485、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、600、601、602、603、604、605、 606、607、608、609、610、611、612、614、615、616、617、618、619或其组合。本发明的8狀卩突变 包括编码本文公开的突变的BRAF多肽的任何核酸。
[0025] 本发明提供在自生物样品的微泡中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不 存在的方法，用于在受试者中诊断或预测疾病或医学病况的存在。本发明也提供在自微泡 中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不存在的方法，用于评价或确定患有疾病或 医学病况的受试者的治疗方案。
[0026]BRAF中的种系突变也与发育性疾病例如LE0PARD、Noonan和心-面-皮肤综合征 (cardiofaciocutaenoussyndrome)有关。所有这三种综合征都与BRAF的活化突变有关， 尽管通常比癌症相关的V600E突变较少活化。
[0027] 因为在癌症中发现的RAS/BRAF/MEK/ERK途径突变的高流行，靶向该特定途径及 其信号转导组分的治疗药已经成为大量研究的主题。激酶抑制剂已被证明在治疗一些癌症 中具有一些成功。RAF抑制剂（其包括BRAF-特异性抑制剂）在治疗癌症患者中已经显示 出一些功效。BRAF-特异性抑制剂的实例包括：⑶C-0879和PLX4720。靶向具有BRAF活化 突变的癌症的其它方式包括靶向BRAF的下游效应物，例如MEK，例如通过使用MEK抑制剂。
[0028]BRAF，如本文使用的，是指其基因（尽7编码BRAF蛋白的核苷酸序列）或其蛋白。
[0029] 作为诊断和/或预后工具的微泡 本发明的某些方面是基于以下发现：微泡由肿瘤细胞分泌并在体液中循环。微泡数量 随肿瘤生长而增加。体液中的微泡浓度与相应的活性肿瘤载量成比例。肿瘤载量越大，体 液中的微泡浓度越高。在这些微泡内发现的核酸，以及微泡的其它内容物例如血管生成蛋 白，可用作有价值的生物标志物，用于通过提供遗传谱而进行肿瘤诊断、表征和预后。重要 的是，使用本文所述的方法，可以自微泡中提取的核酸中准确检测具有突变（例如编码具 有V600E突变的BRAF多肽的突变）的生物标志物。这些微泡中的内容物也可用于监测肿 瘤随时间的进展，即通过分析在肿瘤进展期间是否获得其它突变，以及某些突变水平是否 随时间或随治疗进程而增加或减少。
[0030] 本发明涉及在受试者中检测、诊断、监测、治疗或评价疾病或其它医学病况的方 法，包括以下步骤：自受试者的体液分离微泡，和分析外来体内含有的一种或多种核酸。定 性和/或定量分析核酸，并将结果与患有或未患疾病或其它医学病况的一个或多个其它受 试者预期的或获得的结果进行比较。当与一个或多个其它个体相比，所述受试者的微泡核 酸含量的差异的存在，可以指示所述受试者中的疾病或其它医学病况的进展（例如肿瘤大 小和肿瘤恶性程度的变化）、或易感性或倾向的存在或不存在。在其它实施方案中，自所述 受试者分离的微泡内的某些核酸的存在可用于帮助确定可使用的最有效的治疗方案。
[0031] 本发明特征在于在受试者中诊断疾病或其它医学病况的方法。在一些方面，所述 疾病或医学病况是癌症。所述方法包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡 中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在。所 述BRAF突变可以是本文公开的任何突变；优选地，所述BRAF突变是V600E。BRAF突变的存 在指示所述受试者的疾病或医学病况或者发展所述疾病或医学病况的更高倾向的存在。
[0032] 本发明特征在于确定用于治疗患有疾病或其它医学病况的受试者的治疗方案的 方法。在一些方面，所述疾病或医学病况是癌症。所述方法包括自所述受试者的生物样品 中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF