突 变的存在或不存在。所述BRAF突变可以是本文公开的任何突变；优选地，所述BRAF突变是 V600E。在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示肿瘤起始或进展取决于BRAF 的致癌或活化突变。因此，BRAF突变的存在指示所述受试者可以获益于包含激酶抑制剂、 尤其是RAF或BRAF抑制剂的治疗方案。BRAF突变的不存在指示所述受试者可能不会获益 于包含激酶抑制剂、例如RAF或BRAF抑制剂的治疗方案。
[0033] 治疗由突变的BRAF驱动的癌症的药物已经被开发和现在正在被开发。这些药物 中的两种，威罗菲尼和达拉非尼已获美国食品和药品管理局批准用于治疗晚期黑素瘤。威 罗菲尼是B-raf抑制剂，其中断由突变的BRAF(尽7V600E)驱动的B-Raf/MEK/ERK途径。同 样，达拉非尼是突变的BRAF(尽7V600E/K)的强效抑制剂。因此，使用本文所述的方法，已 被鉴定具有突变的BRAF的受试者可以获益于包含靶向或抑制突变的BRAF和/或其下游信 号转导的药剂的治疗方案。例如，所述受试者可以获益于包含威罗菲尼或达拉非尼的治疗 方案，而没有突变的BRAF的受试者可能不会获益于包含威罗菲尼或达拉非尼的治疗方案。 [0034] 在一些方面，本文公开的方法可用于评价受试者对治疗方案的反应性。例如，通过 本文公开的方法可以检测BRAF突变，和BRAF突变的存在指示所述受试者可能对特定治疗 方案具有反应性。例如，所述治疗方案包含激酶抑制剂例如RAF或BRAF抑制剂、或靶向突 变的BRAF和/或来自突变的BRAF的下游信号转导的药物。受试者对特定治疗方案的反应 性的判定可用于选择治疗方案。
[0035] 的确，本文所述的分离方法和技术提供了以下的迄今为止尚未实现的优势：1)选 择性地分析疾病-或肿瘤-特异性核酸的机会，其可通过在液体样品内将疾病-或肿瘤-特 异性微泡与其它微泡分离而实现；2)与通过从液体样品中直接提取核酸所得的收率/完整 性相比，具有更高序列完整性的核酸种类的明显更高的收率；3)可扩展性（scalability)， 例如检测低水平表达的核酸，可通过从更大体积的血清中沉淀更多微泡而增加灵敏度；4) 更纯的核酸，其中在核酸提取步骤之前从微泡沉淀物中排除蛋白和脂质、死细胞碎片和其 它潜在污染物和PCR抑制剂；和5)在核酸提取方法中的更多选择，因为微泡沉淀物的体积 比起始血清的体积小得多，使得可以使用小体积柱滤器从这些微泡沉淀物中提取核酸。
[0036] 微泡优选地是从采自受试者体液的样品中分离出来。如本文使用的，"体液"是 指分离自受试者身体的任何部位的液体样品，优选外周部位，包括但不限于血液、血浆、血 清、尿、痰、脊髓液、胸膜液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、 唾液、乳汁、淋巴系统液、精液、脑脊液、器官系统内液体（intra-organsystemfluid)、腹 水液、支气管肺泡灌洗液（BAL)、囊肿液、肿瘤囊肿液、羊水及其组合。优选地，所述体液是 血浆、血清、脑脊液、腹水液、支气管肺泡灌洗液或囊肿液。在某些实施方案中，优选体液样 品在2-20ml的范围内。在一些方面，可以优选使用较大体积的样品，用于在检测稀有遗传 突变（例如本文所述的BRAF突变）中增加准确率。在一些方面，所述体液样品在以下范围 内：1-25ml，例如，2-25ml、2-20ml、2-15ml、2-10ml、4-25ml、4-20ml、4-15ml、4-10 ml、6_25ml、 6-20ml、6_15ml、6_10ml、8_25ml、8_20ml、8_15ml、10_25ml、10_20ml、 10-15ml、15-25ml或 15-20ml。
[0037] 术语"受试者"意图包括显示出或预料具有微泡的所有动物。在具体的实施方案 中，所述受试者是哺乳动物，人或非人灵长类动物、狗、猫、马、牛，其他农场动物，或啮齿动 物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠等）。术语"受试者"和"个体"在本文可以互换地使用。
[0038] 从生物样品中分离微泡的方法是本领域已知的。例如，差速离心方法描述于 Raposo等人（Raposo等人，1996)的论文，类似的方法详述于本文的实施例部分。阴离子 交换和/或凝胶渗透色谱的方法描述于美国专利号6, 899, 863和6, 812, 023。蔗糖密度梯 度或细胞器电泳的方法描述于美国专利号7, 198, 923。磁性活化细胞分选（MACS)的方法描 述于（Taylor和Gercel_Taylor，2008)。纳米膜超滤浓缩器方法描述于（Cheruvanky等人， 2007)。优选地，可以通过新开发的使用独特微流体平台以高效和选择性地分离肿瘤来源的 微泡的微芯片技术，从受试者的体液中鉴定和分离微泡。该技术，如Nagrath等人（Nagrath 等人，2007)的论文所述，可用于使用该论文教导的类似捕获和分离原理来鉴定和分离微 泡。前述参考文献中的每篇都通过引用结合到本文中，用于这些方法的教导。
[0039] 在一个实施方案中，分离自体液的微泡中，对起源于特定细胞类型，例如，肺、胰 腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝、胎盘、胎儿细胞的 那些进行富集。因为微泡通常携带来自它们的供体细胞的表面分子如抗原，表面分子可以 用于鉴定、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的微泡（Al-Nedawi等人，2008;Taylor 和Gercel-Taylor，2008)。以这种方式，可以对起源于不同细胞群体的微泡中的核酸含量 进行分析。例如，肿瘤（恶性及非恶性）微泡携带肿瘤相关的表面抗原，并可以通过与这些 特异性肿瘤关联的表面抗原而检测、分离和/或富集。在一个实例中，该表面抗原是上皮细 胞粘附分子（EpCAM)，其对来自肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、头颈部癌、和肝起源的微泡 具有特异性，但对血液细胞起源的微泡没有特异性（Balzar等人，1999 ;Went等人，2004)。 在另一个实例中，该表面抗原是CD24,CD24是对尿微泡具有特异性的糖蛋白（Keller等 人，2007)。在又一个实例中，该表面抗原选自以下组的分子：⑶70、癌胚抗原（CEA)、EGFR、 EGFRvIII，和其他变体、Fas配体、TRAIL、铁传递蛋白受体、p38. 5、p97和HSP72。另外，肿瘤 特异性微泡可以表征为缺少表面标记，如⑶80和⑶86。
[0040] 特定细胞类型的微泡的分离可以通过，例如使用对期望表面抗原具有特异性的抗 体、适配体、适配体类似物或分子印迹聚合物完成。在一个实施方案中，该表面抗原对癌症 类型具有特异性。在另一个实施方案中，该表面抗原对细胞类型具有特异性，该细胞类型 不一定是癌性的。基于细胞表面抗原的微泡分离方法的一个实例在美国专利号7, 198, 923 中提供。如美国专利号5, 840, 867号和5, 582, 981、W0/2003/050290以及Johnson等人 (Johnson等人，2008)的出版物中描述的，适配体及其类似物特异性地结合表面分子，并可 以用作重新获得细胞类型特异性的微泡的分离工具。分子印迹聚合物也特异性地识别表 面分子，如美国专利号6, 525, 154、7, 332, 553和7, 384, 589以及Bossi等人（Bossi等人， 2007)的出版物中描述的，并且是重新获得和分析细胞类型特异性微泡的工具。前述参考文 献中的每篇均结合到本文中，用于这些方法的教导。
[0041] 优选地，使用基于亲和力的过滤柱，从体液样品中分离微泡。例如，所述柱含有特 异性地结合肿瘤来源的微泡或来自某种组织（欲患病组织、肿瘤组织）或特异性细胞类型 的微泡的试剂或部分。例如，所述柱含有特异性地结合微泡表面呈现的肿瘤相关抗原的试 剂或部分，使得目标微泡保留在柱上，而其它细胞、碎片和非特异性微泡可被弃去。在使用 基于亲和力的过滤柱之前，可通过离心或过滤，预处理体液样品。
[0042] 或者，微泡可通过离心、过滤和/或浓缩步骤的组合而分离。例如，可以首先通过 使用包括至少一个过滤步骤的方法，预处理体液样品。例如，粗滤器（coursefilter) (0.8 微米）用于去除细胞和细胞碎片。该过滤后可接着超滤步骤，以去除溶剂和小分子分析物， 同时保留微泡。在最初过滤中使用的滤器可以是足以去除细胞和细胞碎片的任何尺寸，例 如，大于0. 22微米的任何尺寸。为了分离微泡，预处理的样品再经过过滤浓缩步骤，其中具 有分子量截止的滤器用于保留和浓缩直径大于10nm的微泡。例如，再将样品浓缩至体积 小于1ml，优选100-200ul。例如，所述分子量截止为至少100kDa。
[0043] 在微泡分离和浓缩后，在核酸提取前，样品用RNA酶抑制剂预处理，以防提取的 RNA的消化并提高提取品质。任选地，所述样品可以用合适缓冲液洗涤至少一次，以进一步 富集或纯化微泡部分。在某些实施方案中，所述样品用合适缓冲液洗涤两次，以进一步富集 或纯化微泡部分。任选地，在DNA和/或RNA提取之前，将浓缩的微泡在用于预处理步骤的 滤器上裂解。
[0044] 任选地，在微泡分离或核酸提取之前，可将对照颗粒加入样品中，以起到内部对照 的作用，以评价微泡纯化和/或核酸提取的效率或品质。这些对照颗粒包括Q-0噬菌体、 病毒粒子或含有对照核酸（例如，至少一个对照靶基因）的任何其它颗粒，其可以是天然发 生的或经重组DNA技术而工程化的。在某些实施方案中，对照颗粒的数量在加入样品前是 已知的。对照靶基因可以用实时PCR分析来定量。对照靶基因的定量测定可用于确定微泡 纯化或核酸提取过程的效率或品质。
[0045] 本文所述的方法可包括使用对照颗粒以确定或评价微泡分离和/或微泡核酸提 取的品质。对照颗粒统指在微泡分离或核酸提取过程期间的某个时间点加入的微泡尺寸范 围的颗粒，其中所述颗粒含有对照核酸，例如DNA或RNA。具体地讲，对照核酸包含所测定或 测量的至少一个靶基因，用于确定在分离或提取过程期间的对照颗粒的回收量。
[0046] 优选地，对照颗粒是Q-P噬菌体，在本文中称为"Q-P颗粒"。用于本文所述的方 法的Q-0颗粒可以是天然发生的病毒颗粒或可以是重组或工程病毒，其中病毒颗粒的至 少一种组分（例如部分基因组或外壳蛋白）是经本领域已知的重组DNA或分子生物学技术 合成的。Q-0是光滑病毒科家族成员，特征在于线性单链RNA基因组，其由3个基因组成， 编码4种病毒蛋白：外壳蛋白、成熟蛋白、裂解蛋白和RNA复制酶。因其与平均微泡大小相 似，所以可用分离微泡的相同纯化方法，从生物样品中容易地纯化Q-0，如本文所述。另外， Q-0病毒单链基因结构的低复杂性对于其在基于扩增的核酸测定中用作对照而言是有利 的。Q-0颗粒含有所检测或测定的对照靶基因或对照靶序列，用于定量测定样品中的Q-0 颗粒的量。例如，对照靶基因是Q-0外壳蛋白基因。在将Q-0颗粒加入尿样品或分离的尿 来源的微泡之后，使用本文所述的提取方法，提取Q-0颗粒的核酸以及微泡和/或尿样品 的核酸。通过RT-PCR分析可以确定Q-0对照靶基因的检测，例如与目标生物标志物（尽7 BRAF)同时。对照靶基因的10倍稀释的至少2、3或4个已知浓度的标准曲线可用于确定 拷贝数。可以比较检测的拷贝数和加入的Q-0颗粒的量，以确定分离和/或提取过程的品 质。
[0047] 在一个优选的实施方案中，在核酸提取前，将Q_f3颗粒加入到尿样品中。例如，在 超滤前和/或预过滤步骤后，将Q-0颗粒加入到尿样品中。
[0048]在某些实施方案中，将 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1，000 或 5, 000拷贝的Q-P颗粒加入到体液样品。在一个优选的实施方案中，将100拷贝的Q-P颗 粒加入到体液样品。Q-0颗粒的拷贝数可以根据Q-0噬菌体感染靶细胞的能力来计算。 因此，Q-0颗粒的拷贝数与Q-0噬菌体的集落形成单位相关。
[0049] 在自生物样品中分离微泡后，可以自分离的或富集的微泡部分中提取核酸。可使 用本领域众所周知的许多程序，自微泡分离核酸分子，对具体的生物样品选择合适的具体 分离程序。提取的核酸可以是DNA和/或RNA。在某些实施方案中，提取DNA。在某些实 施方案中，提取RNA。在某些实施方案中，同时提取DNA和RNA。RNA可以是信使