RNA、转移 RNA、核糖体RNA、小RNA、非编码RNA。在某些实施方案中，在核酸提取过程中可以进行额外 步骤以改进或提高所提取的核酸的品质。这样的额外步骤描述于W02011/009104,其全部内 容都通过引用结合到本文中。
[0050] 高品质RNA提取是高度期望的，因为RNA降解可以严重影响提取的RNA的下游评 价，例如在基因表达和mRNA分析中，以及非编码RNA例如小RNA和微RNA的分析中。本文所 述的新的方法使得能够从生物样品例如微泡中提取高品质核酸，使得可以进行外来体内的 基因表达和突变水平的准确分析。在一个实施方案中，例如，当使用增加浓度的蛋白酶（5X， 10X)或RNA酶抑制剂作为提取增强剂时，从尿微泡中分离RNA的量和完整性明显增加。
[0051] 在一个实施方案中，提取的核酸是RNA。然后优选地将RNA逆转录为互补DNA，然 后进一步扩增。这样的逆转录可以单独进行或与扩增步骤组合进行。组合逆转录和扩增步 骤的方法的一个实例是逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)，其可被进一步修改为定量的例如 定量RT-PCR，如美国专利号5, 639, 606所述，其通过引用结合到本文中，用于该教导。
[0052] 核酸扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应（PCR)(美国专利号5, 219, 727)及 其变体例如原位聚合酶链式反应（美国专利号5, 538, 871)、定量聚合酶链式反应（美国专 利号5, 219, 727)、巢式聚合酶链式反应（美国专利号5, 556, 773)、自我维持序列复制及其 变体（Guatelli等人，1990)、转录扩增系统及其变体（Kwoh等人，1989)、Qb复制酶及其 变体（Miele等人，1983)、冷-PCR(Li等人，2008)或任何其他核酸扩增方法，接着使用 本领域技术人员众所周知的技术来检测扩增的分子。尤其有用的是设计用于检测核酸分子 的那些检测方案，如果这样的分子以极少数量存在的话。前述参考文献通过引用结合到本 文中，用于这些方法的教导。
[0053] 对微泡中存在的核酸的分析是定量和/或定性的。对于定量分析，用本领域已知 方法（描述于以下）测定微泡内的特定的目标核酸的相对或绝对量（表达水平）。对于定 性分析，用本领域已知方法（描述于以下）鉴定微泡内的特定的目标核酸的种类，无论是野 生型或是变体。
[0054]"遗传畸变"用于本文是指微泡内的核酸量以及核酸变体。具体地讲，遗传畸变包 括但不限于，基因（例如，癌基因）或一组基因的过量表达，基因（例如，肿瘤抑制基因例如 p53或RB)或一组基因的不足表达，基因或一组基因的剪接变体的选择性产生，基因拷贝数 变体（CNV)(例如，DNA双微体）（Hahn, 1993)，核酸修饰（例如，甲基化、乙酰化和磷酸 化），单核苷酸多态性（SNP)，染色体重排（例如，倒位、缺失和重复），和基因或一组基因的 突变（插入、缺失、重复、错义、无义、同义或任何其它核苷酸变化），在许多情况下所述突变 最终影响基因产物的活性和功能，导致选择性转录剪接变体和/或基因表达水平的改变。
[0055]对这类遗传畸变的确定可以通过技术人员已知的各种技术来进行。例如，可通过 微阵列分析（美国专利号 6, 913, 879、7, 364, 848、7, 378, 245、6, 893, 837 和 6, 004, 755)和 定量PCR，测定核酸表达水平、选择性剪接变体、染色体重排和基因拷贝数。尤其是，拷贝数 变化可用IlluminaInfiniumII全基因组基因分型测定或Agilent人类基因组CGH微阵 列（Steemers等人，2006)来检测。核酸修饰可通过描述于例如以下文献的方法来测定： 美国专利号7, 186, 512和专利公布W0/2003/023065。尤其是，甲基化谱可通过Illumina DNA甲基化0MA003CancerPanel来测定。SNP和突变可通过以下方法检测：与等位基 因-特异性探针杂交、酶突变检测、错配异源双链体的化学切割（Cotton等人，1988)、错 配碱基的核糖核酸酶切割（Myers等人，1985)、质谱（美国专利号6, 994, 960，7, 074, 563 和7, 198, 893)、核酸测序、单链构象多态性（SSCP) (Orita等人，1989)、变性梯度凝胶 电泳（DGGE)(Fischer和Lerman, 1979a;Fischer和Lerman, 1979b)、温度梯度凝胶电 泳（TGGE)(Fischer和Lerman, 1979a;Fischer和Lerman, 1979b)、限制性片断长度多 态性（RFLP)(Kan和Dozy, 1978a;Kan和Dozy, 1978b)、寡核苷酸连接测定（OLA)、等 位基因-特异性PCR(ASPCR)(美国专利号5, 639, 611)、连接链式反应（LCR)及其变体 (Abravaya等人，1995;Landegren等人，1988;Nakazawa等人，1994)、流式细胞异源双 链体分析（W0/2006/113590)及其组合/修改。显著地，基因表达水平可以通过基因表达 (SAGE)技术的系列分析而测定（Velculescu等人，1995)。一般而言，分析遗传畸变的方 法在大量出版物中都有报告，不限于本文引用的那些，并且可被技术人员利用。合适的分析 方法将取决于特定分析目标，患者的病况/病史，和所检测、监测或治疗的具体的癌症、疾 病或其它医学病况。前述参考文献结合到本文中，用于这些方法的教导。
[0056] 在一个实施方案中，疾病例如癌症相关基因的突变（例如，经由核苷酸变体，过量 表达或不足表达）通过分析微泡中的核酸而检测，所述核酸来源于起源细胞中的基因组本 身或通过病毒引入的外源基因。核酸序列可以是完整的或部分的，因为这两者都预期得到 疾病诊断和预后的有用信息。所述序列可以是对实际基因或转录序列而言有义的或反义 的。技术人员将能够设计用于自可存在于微泡中的有义或反义核酸的核苷酸变异的检测方 法。许多这类方法包括使用探针，其对其直接侧接的核苷酸序列或含有核苷酸变异的核苷 酸序列具有特异性。这样的探针可由技术人员考虑到基因序列的知识和基因中的核酸变体 的位置而设计。这样的探针可用于分离、扩增和/或实际上杂交，以检测核酸变体，如本领 域和本文所述。
[0057] 确定受试者的微泡内的核酸中的特定核苷酸变体或多个变体的存在或不存在，可 以以各种方式进行。对于这样的分析，各种方法是可得的，包括但不限于，PCR、与等位基 因-特异性探针杂交、酶突变检测、错配的化学切割、质谱或DNA测序，包括微测序。在具体 的实施方案中，与等位基因_特异性探针杂交可以以两种方式进彳丁 ：1)在溶液中，等位基因 特异性寡核苷酸结合到固相（玻璃、硅、尼龙膜）和标记的样品，如同许多DNA芯片应用中， 或2)在溶液中，结合的样品（通常是克隆的DNA或经PCR扩增的DNA)和标记的寡核苷酸 (或等位基因特异性的或短的，以便允许通过杂交而测序）。诊断测试可以包括一组变异， 通常在固体支持物上，其能够同时确定超过一个变异。在另一个实施方案中，确定微泡核酸 中的至少一个核酸变异的存在需要单体型分析测试。确定单体型的方法是本领域技术人员 已知的，例如在W0 00/04194中。
[0058] 在一个实施方案中，核酸变体的存在或不存在的确定包括通过例如以下方法确定 变体位点的序列（其中出现偏离正常的核酸变异的序列内的准确位置）：聚合酶链式反应 (PCR)、链终止DNA测序（美国专利号5547859)、小测序（Fiorentino等人，2003)、寡核苷 酸杂交、焦磷酸测序、Illumina基因组分析仪、深度测序、质谱或其它核酸序列检测方法。检 测核酸变体的方法是本领域众所周知的并公开于W0 00/04194,通过引用结合到本文中。在 示例性的方法中，诊断测试包括扩增DNA或RNA区段（通常在RNA转化为互补DNA之后）， 其在期望的基因序列中跨越一个或多个已知变体。再对该扩增区段测序和/或经过电泳， 以鉴定扩增区段中的核苷酸变体。
[0059] 在一个实施方案中，本发明提供在如本文所述分离的微泡核酸中筛选核苷酸变体 的方法。这可以例如通过PCR或在连接链式反应（LCR) (Abravaya等人，1995;Landegren 等人，1988;Nakazawa等人，1994)中实现。LCR在目标基因中的点突变检测中可以是特 别有用的（Abravaya等人，1995)。LCR方法包括设计简并引物的步骤，用于扩增靶序列， 所述引物对应于对应于目标基因的核酸的一个或多个保守区，用引物扩增PCR产物，使用 得自微泡的核酸作为模板，和分析PCR产物。将微泡核酸的PCR产物与对照样品（或具有 核苷酸变体或没有）比较，指示微泡核酸中的变体。改变可以是在微泡核酸中不存在或存 在核苷酸变体，取决于对照。
[0060] 可进行扩增产物的分析，使用能够按其尺寸分离扩增产物的任何方法，包括自动 和手动的凝胶电泳、质谱等。
[0061] 或者，使用SSCP、DGGE、TGGE、化学切割、0LA、限制性片断长度多态性以及杂交，例 如核酸微阵列，可根据序列差异分析扩增产物。
[0062] 核酸分离、扩增和分析的方法对于本领域技术人员而言是常规的，方案的实例 可以在例如以下文献中找到：MolecularCloning:ALaboratoryManual(3-Volume Set)Ed.JosephSambrook,Davidff.Russel,和JoeSambrook,ColdSpringHarbor Laboratory,第三版（2001年1月15日），ISBN: 0879695773。用于PCR扩增的方法的一 个特别有用的方案来源是PCRBasics:FromBackgroundtoBenchbySpringerVerlag; 第一版（2000 年 10 月 15 日），ISBN: 0387916008。
[0063] 在肿瘤活检样品上进行诊断的许多方法可用微泡进行，因为肿瘤细胞，以及一些 正常细胞，已知会脱落微泡到体液中，并且这些微泡内的遗传畸变反映了肿瘤细胞内的那 些，正如本文证明的。此外，使用微泡的诊断方法具有在肿瘤活检样品上直接进行诊断的方 法所没有的特征。例如，相比肿瘤/癌症核酸的其它采样形式，微泡核酸分析的一个特别优 势就是分析来自个体中存在的所有肿瘤病灶或遗传上不均匀肿瘤的肿瘤/癌症核酸的可 用性。活检样品是受限的，因为它们提供仅仅对于肿瘤特定病灶（从中获得活检）的信息。 体内发现的、或甚至在单一肿瘤内发现的不同的瘤/癌病灶通常具有不同的遗传谱并且在 标准活检中无法分析。然而，对来自个体的微泡核酸的分析有可能提供个体内所有病灶的 采样。这为推荐的治疗、治疗有效性、疾病预后和疾病复发的分析，提供了简单活检所无法 提供的有价值的信息。
[0064] 本文所述的方法对特定疾病和/或医学病况相关的遗传畸变的鉴定，也可用于经 诊断患有疾病或其它医学病况例如癌症的个体的预后和治疗决策。对疾病和/或医学病况 的遗传基础的鉴定提供了有用的信息，指导对疾病和/或医学病况的治疗。例如，许多形式 的化学治疗已被证明对具有特定遗传异常/畸变的癌症更有效。一个实例是使用BRAF抑 制剂来治疗具有BRAF活化突变的癌症。在某些实施方案中，使用联合治疗可能是有用的， 其中所述联合治疗包括BRAF抑制剂和另一化疗药、药物、手术或放疗。
[0065] 也已发现其它基因中的遗传畸变影响治疗的有效性。正如在Furnari等人 (Furnari等人，2007)中公开的，多个基因中的突变影响了用于治疗脑癌的化学治疗中的 特定药物的有效性。对微泡内核酸的这些遗传畸变的鉴定将指导选择适当的治疗计划。 [0066] 因此，本发明的方面涉及在受试者中监测疾病（例如癌症）进展的方法，并且也涉 及在个体中监测疾病复发的方法。这些方法包括以下步骤：如本文讨论，自个体体液中分离 微泡，和如本文讨论地分析微泡内的核酸（例如产生微泡的遗传谱）。某种遗传畸变/谱的 存在/不存在用于指示受试者中的疾病（例如癌症）的存在/不存在，如本文讨论。随着 时间，定期进行该过程并检查结果，以监测疾病进展或消退，或确定疾病的复发。换句话说， 遗传谱中的变化指示受试者的疾病状态变化。在受试者的微泡取样以进行微泡分离