时，判定为弱阳性；检测孔OD值< 0. 1判定为阴性。
[0054] 试验表明，本发明的空肠弯曲菌酶联免疫试剂盒，有较高的灵敏度和准确度。板间 误差小于5 %，板内CV小于3 %。与单增李斯特、猪霍乱沙门、鼠伤寒沙门、肠炎沙门、福氏 志贺、宋内氏志贺、鲍氏志贺、出血性大肠杆菌0157:H7、阪崎肠杆菌、小肠耶尔森氏菌等共 计91种细菌（株）均无交叉反应，此为本发明的最大创新点。
[0055] 总之，本发明的试剂盒对样品的前处理要求低，操作简便，检测极限为105cfu/ml， 特异性和稳定性好，并与大多数食源性致病菌都没有交叉反应。
[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory PreSS，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0057] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0058] 实施例1.抗空肠弯曲菌单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的制备
[0059] -、免疫原和阳性标准品的制备
[0060] 空肠弯曲菌（CICCNo. 22937)接种在布氏肉汤上，37°C、150r/min振荡培养17h， 计数，加入0. 3%甲醛溶液室温灭活1天。用生理盐水调整空肠弯曲菌（CICCNo. 22937)浓 度至5X109cfu/ml作为免疫原；用生理盐水调整浓度为10scfu/ml作为阳性对照标准品，布 氏肉汤为阴性对照标准品。
[0061] 二、单克隆抗体的制备
[0062] 1、实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0063] 2、免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一 次。
[0064] 3、采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血 清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0065] 4、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融 合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5%CO2培养箱培养。
[0066] 5、杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将 其转移至24孔培养板。
[0067] 6、克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔 底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 - 4次，直至阳性率达到 100 %。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6个 杂交瘤细胞，7~10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。
[0068] 三、单克隆抗体纯化及鉴定
[0069] 腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化；纯 化后的抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价（见表1);再用SDS-PAGE分析纯度，5% 积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像 分析系统观察结果（见图1)。
[0070] 表1.两株单克隆抗体效价测定结果（OD4m)
[0071]
[0072] 实施例2.单克隆抗体4C9E1G7H3和3G2D8H3G9的特性鉴定
[0073] 一、单克隆抗体亚类鉴定
[0074] 1、抗原包被：用0.OlMPBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50y1，4°C包被过夜， 次日弃去孔内液体，洗板3遍。
[0075] 2、封闭：每孔加入1%BSA200y1，4°C封闭过夜。次日拍干板子不洗板。
[0076] 3、加入单克隆抗体杂交瘤细胞上清，每个样品8个微孔，每孔50yl。37°C，孵育 lh〇
[0077] 4、洗板4遍后，分别加入特异结合的兔抗鼠IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM， K，A，37°C孵育lh。
[0078] 5、洗板4遍后，每孔加入已稀释好的辣根过氧化物酶标记抗兔二抗IgG(H+L)， 37°C，孵育 30min。
[0079] 6、洗板4遍后，加入100y1底物显色液，37°C，避光显色lOmin。于450nm波长下 读取结果。
[0080] 如表2所不，H3属于IgG2a亚类，G9属于IgGl亚类。
[0081] 表2.两株单克隆抗体亚类鉴定结果
[0082]
[0083] 二、单克隆抗体交叉反应测试
[0084] 1、抗原包被：将96种10scfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌 加3各孔，每孔100yI，4°C，包被过夜。
[0085] 2、封闭：洗板3遍后，每孔加入3%BSA200y1，37°C孵育2h。
[0086] 3、洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100y1，37摄氏度孵育lh。
[0087] 4、洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100y1，37摄氏 度孵育Ih。
[0088] 5、洗板4遍。加入底物显色液，37°C，避光显色15min。于450nm波长下读取结果。
[0089] 表3.两株单克隆抗体交叉反应检测结果
[0090]
[0094] 实施例3.检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒的组成、制备及其应用
[0095] -、酶联免疫试剂盒由下述物质组成
[0096] (1)预包被抗体的酶标板：用0. 02M醋酸缓冲液（pH2. 0)溶液稀释、抗空肠弯曲 菌单克隆抗体3G2D8H3G9包被96孔酶标板，每孔100y1。4°C孵育过夜，按照常规ELISA方 法封闭洗潘。
[0097] (2)空肠弯曲菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。
[0098] (3)辣根过氧化物酶标记的抗空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3。
[0099] (4)酶标抗体稀释液：0?OlMPBS，pH7. 6。
[0100] (5)IOX浓缩洗液：含有0? 5%吐温-20和0? 2%叠氮钠的0?IM磷酸盐缓冲液，pH 7. 4,使用时将浓缩洗液10倍稀释即可。
[0101] (6)显色液A液，显色液B液。使用前将A液与B液等体积混合。
[0102] (7)终止液：2M硫酸溶液。
[0103] 二、酶联免疫试剂盒中各组分的制备
[0104]( -）将空肠弯曲菌单克隆抗体3G2D8H3G9作为捕捉抗体包被酶标板
[0105] 用包被缓冲液将空肠弯曲菌单克隆抗体3G2D8H3G9稀释成5yg/ml，每孔加入 100y1，4°C过夜，次日倾去包被液，用稀释好的洗液洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入 220y1封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝箱袋密封保存。
[0106] 包被缓冲液：0?02M醋酸缓冲液，用5MHCl调节pH至2. 0。
[0107] 封闭液：含有0. 3%牛血清白蛋白和10%蔗糖的0.OlMPBS。
[