lin300 的 pH7.4 Tris-HCl 缓冲液。
[0093]清洗液为包含0.2%BSA、0.5% 吐温 20、0.5% 曲拉通 Χ-100 和 0.01 % Proclin300的pH7.4Tris-HCl缓冲液。发光基底液分A液和B液，A液为含金刚烷的酸性溶液，B液为碱性溶液。
[0094]将ALP标记抗体溶液放入顶板酶标配体存储池(5)中，密封。将他克莫司标记的磁颗粒溶液放入底板包被区(7)中，室温干燥。将清洗液注入清洗液存储池(9)中，将发光基底液的A液和B液分别注入发光基底液存储池A (16)和发光基底液存储池B (17)，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。
[0095](三)样本检测
[0096]用磷酸缓冲液作稀释液，将他克莫司标准品配制系列浓度标准品溶液如下:0ng/mL、0.1ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mLo
[0097]将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为2000高斯)中，往加样口滴入50 μ 1标准品，样本过滤后，到达微通道，溶解磁颗粒并反应，然后磁铁收集磁颗粒。存储池释放ALP标记他克莫司，并与磁颗粒复合物反应，ALP标记他克莫司竞争与他克莫司结合的磁颗粒标记抗体。清洗液存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。
[0098]将50 μ 1全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中他克莫司浓度。
[0099]检测原理为:当样本加入微流控芯片，经过滤区后到达微通道，样本溶解磁颗粒标记抗体。当样本中含有他克莫司，则他克莫司与磁颗粒标记抗体反应。磁铁收集磁颗粒。存储池释放ALP标记他克莫司，ALP标记他克莫司竞争与他克莫司结合的磁颗粒标记抗体(竞争法)。经清洗后，在发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析样本中他克莫司浓度。样本中他克莫司含量越高，则发光信号越弱。
[0100]结果表明，他克莫司最低检测限为0.1ng/mL，最低定量限为0.2ng/mL，检测范围内的线性相关系数R2> 0.96，在定量检测范围内，未出现HOOK效应；且批内与批间重复性均小于12%，可用于他克莫司血药浓度检测。
[0101]实施例3:磁微粒颗粒尺寸筛选
[0102]其他的实验条件参见实施例1，磁颗粒尺寸和磁铁磁感应强度按照以下方案进行。
[0103]颗粒尺寸为0.1 μ m、0.5 μ m、1.1 μ m、1.5 μ m、2.5 μ m、3 μ m、10 μ m。磁铁磁感应强度为500高斯、1000高斯、4000高斯、8000高斯、12000高斯、30000高斯。分别以这六种磁铁分别驱动七种尺寸的磁颗粒。
[0104]实验结果显示:0.1 μπι磁颗粒和500高斯磁铁组合时，其最低检测限为50pg/ml，定量检测范围为50?5000pg/ml，线性相关系数R2> 0.90 ;批内与批间重复性均小于20%。即:化学发光信号较弱，灵敏度不高，重复性较差。
[0105]10 μ m磁颗粒和30000高斯磁铁组合时，其最低检测限为100pg/ml，定量检测范围为100?5000pg/ml，线性相关系数R2〉0.92 ;批内与批间重复性均小于20%。即:阴性样本信号较高(清洗不充分)，线性范围不宽。
[0106]0.5?3 μ m的磁颗粒为和1000?8000高斯的磁铁组合使用时，其最低检测限均小于20pg/ml，定量检测范围可达到10?10000pg/ml，线性相关系数R2> 0.97 ;批内与批间重复性均小于12%。满足为临床心梗心衰疾病诊断提供参考的需要。
[0107]根据以上结果，磁颗粒尺寸优选0.5?3 μ m，磁铁磁感应强度优选1000?8000高斯。可根据磁颗粒所用尺寸，进一步确定磁铁磁感应强度。
[0108]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种用于全血样品检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述芯片由顶部胶带(12)、芯片基板(I)和底部胶带(15)构成，其中芯片基板上的过滤区(2)、包被区(3)、反应区(5)、清洗区(6)、检测区(7)、液体释放通道(8)依次连接，芯片基板上标记配体存储池(4)与反应区(5)连接，检测区(7)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(8)连接，顶部胶带包含加样口(13);所述包被区(3)中包被磁颗粒标记配体；标记配体存储池(4)存储酶或发光剂标记配体。2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述发光基底液存储池(10)由发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)替代，发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)通过发光液预混合通道(18)连接。3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述过滤区包含滤血膜，其中滤血膜可通过物理孔径或生物、化学试剂使液体与细胞分离，所述生物、化学试剂为凝血剂。4.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述磁铁可置于微流控芯片的顶部胶带之上或底部胶带之下。5.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记配体使用的磁颗粒包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，磁颗粒尺寸为0.1?10 μ m，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为500?30000高斯。6.如权利要求5所述的芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记配体使用的磁颗粒包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，磁颗粒尺寸为0.5?3 μπι，与磁珠匹配的磁铁磁感应强度为1000?8000高斯。7.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述磁颗粒标记配体、酶或发光剂标记配体使用的配体包含核酸、抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和激素受体，所述分析物包括DNA、小分子(药物或毒品)、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物。8.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述清洗液存储池(9)预存储清洗液，所述清洗液包含缓冲体系、蛋白质和表面活性剂，其中缓冲体系选自硼酸盐、磷酸盐、Tris-HCl、醋酸盐中的一种；蛋白质选自牛血清白蛋白、酪蛋白中的一种；表面活性剂选自吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮中的一种。9.如权利要求1或2所述的芯片，其特征在于，所述微流控芯片测试流程如下: 步骤I)将微流控芯片放入配套仪器，把样本滴入加样口(13)后，开始测试，样本经过滤区(2)后，溶解包被区(3)固定的磁颗粒标记配体，样本中分析物与磁颗粒标记配体反应，磁铁收集磁颗粒，标记配体存储池(4)释放溶液，磁铁将磁颗粒移至反应区(5)，磁铁搅拌加速反应，充分反应后收集磁颗粒； 步骤2)清洗液存储池(9)释放溶液，磁颗粒清洗后，被移至检测区(7)，发光基底液存储池(10)释放溶液，检测区产生化学发光信号，仪器检测系统检测发光信号强度，进而实现分析物的定量检测。10.如权利要求9所述的芯片，其特征在于，芯片检测的样本体积为20?100μ I ;芯片配套仪器为小型便携设备，包含挤压存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能，芯片放入仪器后，点击开始测试，仪器可自动完成所有操作。
【专利摘要】本发明公开了一种用于全血样品检测的磁微粒化学发光微流控芯片，所述芯片由顶部胶带(12)、芯片基板(1)和底部胶带(15)构成，其中芯片基板上的过滤区(2)、包被区(3)、反应区(5)、清洗区(6)、检测区(7)、液体释放通道(8)依次连接，芯片基板上标记配体存储池(4)与反应区(5)连接，检测区(7)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(8)连接，顶部胶带包含加样口(13)；所述包被区(3)中包被磁颗粒标记配体；标记配体存储池(4)存储酶或发光剂标记配体。
【IPC分类】G01N33/53, G01N21/76
【公开号】CN105241871
【申请号】CN201510696706
【发明人】王东, 李泉
【申请人】深圳华迈兴微医疗科技有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月26日