合物Ic 0. 5克，加入2ml水溶解，用IM HCl调PH至3~4,加入IOml乙醇， 搅拌1小时，抽滤，得化合物Id，40°C鼓风干燥3小时，得0. 45克。
[0077] 用实施例8中的HPLC方法检测纯度，98. 8 % (面积归一法）。ESI质谱（正离 子）：372. 4[M+Na] +。卡尔-费休氏法测定水分：10. 07%。
[0078] 实施例7
[0079] 化合物Ia 2水物、化合物Ic 2水物的制备
[0080] 分别取化合物Ia、Ic各500mg，用蒸馏水配成10%的溶液，于-20°C下快速冷冻， 然后冷冻干燥。结束后，用卡尔-费休氏法分别测定水分，结果如下：
[0081] 表4水分含量
[0084] 实施例8
[0085] 液相色谱法检测磷酸肌酸钠样品中化合物Ia的含量
[0086] 1 材料
[0087] I. 1仪器和材料
[0088] Agilent IlOOSeries高效液相色谱系统；DAD检测器。
[0089] 1.2药品与试剂
[0090] 乙腈为色谱纯；水为纯化水；磷酸二氢钠、四丁基氢氧化铵水溶液（10% )为分析 纯。
[0091] 对照品：化合物Ia的8水合物，纯度98. 6%，水分（卡尔-费休氏法）30. 06%。
[0092] 供试品：磷酸肌酸钠粗品、经反复精制的磷酸肌酸钠。
[0093] 2 方法
[0094] 2. 1色谱条件
[0095] 色谱柱：Megres C18 柱（4. 6 X 150mm)
[0096] 流动相：乙腈：水（含0. 2 %磷酸二氢钠、0. 1 %四丁基氢氧化铵，用磷酸或氨试液 调节pH值至6.6) = 20 :80
[0097] 波长：2IOnm
[0098] 流速：lml/min
[0099] 进样量：20 μ 1
[0100] 柱温：室温
[0101] 2. 2线性范围
[0102] 用流动相将化合物 Ia配制成 2. 5 μ g/ml、5 μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml 和 100 μ g/ ml的对照品溶液，浓度按无水物计。各取20μ1在测定条件下进样，对照品的绝对进样 量分别为50即、0.148、0.5 48、1.(^8和2.(^8。在2.1所述的色谱条件下测定。以 峰面积为纵坐标（Y)，化合物Ia进样量为横坐标（X)，进行线性回归，得到回归方程：Y = 32926Χ+4714. 1，R2 = 0. 9999
[0103] 2. 3精密度
[0104] 分别取浓度为25 μ g/ml的对照品溶液，每次进样20 μ 1，连续进样6次，记录峰面 积，计算精密度。
[0105] 2. 4稳定性
[0106] 分别取浓度为50 μ g/ml、5 μ g/ml的对照品溶液，各自在0h、2h、4h、6h进样，记录 峰面积，考察稳定性。
[0107] 精密称取磷酸肌酸钠粗品和精制品样品适量，用流动相溶解，配成5mg/ml的溶 液，分别在〇h、2h、4h、6h进样，记录杂质Ia峰面积，考察稳定性。
[0108] 2. 5重现性
[0109] 取磷酸肌酸钠粗品和反复精制样品分别进行6次平行测定，计算相对标准偏差 (RSD% )，考察重现性。
[0110] 2. 6加样回收率
[0111] 精密称取磷酸肌酸钠粗品Ig共6份和反复精制样品Ig共6份，前者每份分别加入 IOmg对照品，后者每份分别加入1ml浓度为lmg/ml的对照品溶液，对照品均按无水物计，流 动相溶解并稀释至5mg/ml，在2. 1所述的色谱条件下测定，计算化合物Ia的回收率。
[0112] 2.7供试品测定
[0113] 精密称取磷酸肌酸钠相关样品适量，用流动相配成5mg/ml的溶液，分别精密吸取 对照品溶液和供试品溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。测定磷酸肌酸钠粗品时使 用50 μ g/ml的对照品溶液（对照品溶液1)，测定磷酸肌酸钠精制品时使用5 μ g/ml的对照 品溶液（对照品溶液2)。
[0114] 3 结果
[0115] 供试品中化合物Ia与其他峰基线分离，峰形较好，理论塔板数达3500以上；化合 物Ia的检测限为10ng，磷酸肌酸钠对化合物Ia的分析无干扰；化合物Ia的线性范围为 50ng~2 μ g ;精密度良好，RSD为0. 25% ;对照品50 μ g/ml、5 μ g/ml在6小时内稳定，RSD 分别为〇. 78%，0. 89%，磷酸肌酸钠粗品和精制品的供试品中的Ia在6小时内稳定，RSD分 别为0. 81 %，0. 90% ;本测定方法具有良好的重现性，磷酸肌酸钠粗品RSD为0. 87%，精制 品RSD为0. 92% ;化合物Ia加样回收率，磷酸肌酸钠粗品为99. 85%，RSD为1. 03%，精制 品为 99. 47%，RSD 为 L 35%。
[0116] 测定的6批磷酸肌酸钠粗品中化合物Ia的含量分别为1. 03%、I. 01 %、0. 78 %、 1.56 %、2. 01 %和1.05% ;6批经反复精制的磷酸肌酸钠中化合物Ia的含量分别为0、 0. 05%、0、0、0. 02%和0. 08%。磷酸肌酸钠粗品、经反复精制的磷酸肌酸钠 HPLC色谱图见 图3和图4,图3中，峰1为磷酸肌酸钠，峰2为化合物la。
[0117] 实施例9
[0118] 液相色谱法检测磷酸肌酸钠样品中化合物Ia的含量
[0119] 以下表中的化合物为对照品来检测磷酸肌酸钠样品中化合物Ia的含量。测定的 方法及条件与实施例8相同。对照品溶液浓度，均按照无水物计。
[0120] 表5不同对照品测试结果
[0123] 实施例10
[0124] 液相色谱法检测磷酸肌酸钠样品中化合物Ia的含量
[0125] 以化合物Ia的8水合物为对照品。以下表中的条件为流动相，其余条件与实施例 8相同，检测磷酸肌酸钠样品中化合Ia的含量。
[0126] 表6不同流动相测试结果
[0128] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种 相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述杂 质化合物具有如下式（la)所示的结构：对杂质化合物la进行检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中以 乙腈或甲醇为有机相、以缓冲盐及离子对试剂的水溶液为水相，检测器为紫外检测器。2. 根据权利要求1所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：所述检测方法以Ia、Ib、Ic或Id为对照品，Ib、Ic、Id具有式（I)所示的结构 通式：其中，对于Ib，Ml为Na，M2为Η;对于Ic，Ml为K，M2为K;对于Id，Ml为K，M2为Η; la、lb、Ic和Id的制备方法如下： (1) la的制备 富集副产物的磷酸肌酸二钠盐粗品，加甲醇超声处理两次，倾去上层，沉淀加水使溶 解，再加入甲醇或乙醇，搅拌均匀，过滤，滤液于〇~l〇°C放置结晶，再用水-甲醇或水-乙 醇重结晶一次，滤出，干燥，即可得化合物la纯品，纯度大于98% ; (2)Ib的制备 取化合物la加水溶解，用1MHC1调PH至3~4,加入乙醇搅，抽滤，即得化合物lb; (3)Ic的制备 将由肌酐和三氯氧磷缩合反应得到的肌酐磷酰氯，边搅拌边缓慢加入到质量浓度为 20 %的KOH溶液中，搅拌过夜，用盐酸调PH至7~8,搅拌下加入溶液体积4倍量的乙醇， 静置数小时后，抽滤，得到磷酸肌酸钾粗品，富集副产物后，加甲醇超声处理两次，倾去上 层，沉淀加水使溶解，再加入甲醇或乙醇，搅拌均匀，过滤，滤液于0~l〇°C放置结晶，再用 水-甲醇或水-乙醇重结晶一次，滤出，干燥，即得到化合物Ic纯品； (4) Id的制备 取化合物Ic加水溶解，用1MHC1调PH至3~4,加入乙醇搅拌，抽滤，即得化合物Id。3. 根据权利要求2所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于：取Ia、Ib、Ic或Id纯品，溶解于流动相中，分别制成50μg/ml的对照液1和 5μg/ml的对照液2 ;取待测样品溶解于流动相中，配制成5mg/ml的待测液；待测液为磷酸 肌酸钠粗品时使用对照液1，分别吸取等量的对照液1和待测液注入液相色谱仪，测定磷酸 肌酸钠粗品中la的含量；待测液为磷酸肌酸钠精制品时使用对照液2,分别吸取等量的对 照液2和待测液注入液相色谱仪，测定磷酸肌酸钠精制品中la的含量。4. 根据权利要求1所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：有机相与水相的体积比为0-40:60-100。5. 根据权利要求4所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：有机相与水相的体积比为20:80。6. 根据权利要求1所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：有机相为乙腈。7. 根据权利要求1所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：水相中缓冲盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，离子对试剂为四丁基氢氧化铵或四 丁基溴化铵或十二烷基三甲基氯化铵，pH为4-8。8. 根据权利要求7所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，其 特征在于：水相中缓冲盐含量为0. 2wt%，离子对试剂含量为0.lwt%，pH为6. 3-6. 8。9. 根据权利要求1-8任一项所述的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检 测方法，其特征在于：紫外检测波长为210nm。
【专利摘要】本发明属于制药技术领域，具体涉及一种磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，所述杂质化合物具有如下式(Ia)所示的结构，对杂质化合物Ia进行检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中以乙腈或甲醇为有机相、以缓冲盐及离子对试剂的水溶液为水相，检测器为紫外检测器。本发明的磷酸肌酸二钠盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，用以控制磷酸肌酸钠粗品及终产品中化合物Ia的含量，能加强对磷酸肌酸钠质量的有效控制。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN105259286
【申请号】CN201510700788
【发明人】曾佳烽, 李宝莹, 吴光明, 方通, 潘俊芳
【申请人】上海华拓医药科技发展有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月26日