一种揭示药物活性成分及其组合的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于制药领域，涉及一种揭示药物活性成分及及其组合，尤其涉及一种从 丹七方中发明在抑制凝血酶方面具有联合用药价值的药物组合。
【背景技术】
[0002] 中草药发展历史悠久，通过经验相传或古籍记载流传至今。而中药复方，作为配伍 规律的具体应用形式，具有丰富奥妙的科学内涵和组合变化规律。近几十年来，随着高通量 筛选技术的崛起，很多中外学者把研究兴趣放在从草药中筛选具有潜力的先导结构或新的 活性分子。然而，有个不可忽略的事实是中药里成分复杂多样、含量层次不齐，为新药筛选 带来了极大的麻烦。因此，从筛选化合物库的角度，在筛选之前对中药提取物进行必要的改 造和优化是影响后续活性化合物筛选的重要因素。
[0003] 而另一方面，西药"单一药物作用于单一靶点"的药物作用模式对中药研究造成了 极大的冲击:很多中药研究工作过分关心某一个单体成分，忽视了中药药效是在中医指导 下的多成分整合作用的结果。目前专门针对中药多成分组合相互作用的筛选方法或理论少 之又少。如何揭示中药尤其是中药复方所包含的多成分组合产生的相互作用，对于中药研 究及现代化具有重要意义。
【发明内容】
[0004] (一)要解决的技术问题
[0005] 本发明要解决的问题在于:建立一种基于化学家族分类和天然化合物库优化的既 能快速、准确辨识其生物活性小分子，又能全面揭示多成分间相互作用关系的筛选方法。
[0006] (二)技术方案
[0007] 本发明涉及一种揭示药物活性成分及其组合的方法，该方法包括如下步骤：
[0008] 步骤1:对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物 分成不同的化学家族。
[0009] 步骤2:对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积。
[0010] 步骤3:从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表 在同一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该 标准看齐，对天然化合物库改造。
[0011] 步骤4:应用高通量筛选技术对改造后的天然化合物库进行扫描并找到活性化合 物。
[0012] 步骤5:围绕活性化合物所在的化学家族，选用指标或模型评价家族内和家族间组 合的多成分相互作用关系，这种关系可能是拮抗、相加、协同或者无明显相互关系。
[0013] 本发明的步骤1中的药物提取物的来源包括而不限于:植物提取物、动物提取物、 微生物提取物、真菌提取物、矿物提取物等天然产物。
[0014] 本发明的步骤1中的所述结构相似性为在结构、官能团、药效团、或分子量等方面 具有的相似性。
[0015] 本发明的步骤1中的化合物结构鉴定为基于质谱的化合物分子量和特征碎片离子 比对或基于核磁共振技术、红外光谱、紫外光谱的化合物结构解析。
[0016] 本发明的步骤1中的色谱分离为分析型、半制备型或制备型的高效液相色谱。
[0017] 本发明的步骤2中的色谱图进行分解为通过色谱图的保留时间设置时间窗，以色 谱峰为单位的馏分收集。
[0018] 本发明的步骤3中的容易获取的化合物为在天然产物中丰度高且易制备纯化的标 准品、或者市场上价格便宜的标准品。
[0019] 本发明的步骤3中的重新组合为按照规则，通过手动移液器或自动化仪器对各个 馏分进行混合。
[0020] 本发明的制备方法，步骤3中的规则是：
[0021] 本发明的步骤4中的所述高通量筛选技术为多孔道酶标仪检测或基于靶细胞和靶 蛋白的亲和色谱筛选。
[0022] 本发明的步骤5中的指标或模型为Combination Index理论、Bliss independence 模型、Loewe additivism模型或者剂量依赖性的相互作用趋势。
[0023] 本发明涉及一种药物活性成分的重新组合方法;该方法包括如下步骤：
[0024] 步骤1:对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物 分成不同的化学家族。
[0025] 步骤2:对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积
[0026] 步骤3:从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表 在同一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该 标准看齐，对天然化合物库进行改造。
[0027] 重新组合的具体步骤：
[0028] 假设某提取物中含有X个成分(例如18个成分），这18个成分对应的……峰面积为 Al、A2、A3......Al8，
[0029] 根据化学结构相似性被分为L、M、N三个化学家族：
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 从L、M、N中各选一个易于获得标准品的化合物作为代表。测试其在某一浓度的峰 面积分别记为At、Af、A=。例如在酶活性测试时通常会选用?〇〇μΜ作为先导浓度以初步 判断化合物是否具有值得深入研究的价值。趑，也' 即为各自家族成员所需用于测试活 性的量。用峰面积作为同一化学家族重新组合的标准，依据为记录在中国药典和美国药典 的一测多评方法(如下）：
[0034] 假设某一个样品含有i个组分
[0035] Ci/Ai = fi(i = l，2, · · ·，s. · ·，k) ①
[0036] 式中仏为组分峰面积，(^为组分浓度。选取其中一组分s为内标，建立组分s与其他 组分间的相对校正因子：
[0037] fsk = fs/fk=(CsXAk)/(CkXAs) ②
[0038] Ck=(CsXAk)/(fskXAs) ③
[0039] 式子中As为内标物峰面积，Cs为内标物浓度。Ak为其他组分k的峰面积;C k为其他组 分k的浓度。当分析物具有相似的化学结构、吸收特性时，相对校正因子可以视为1。因此，上 述公式在同系物中可以简化为:Ck = (Cs X Ak)/As。当代表性化合物S在某一浓度(e . g. Cs = 1 ΟΟμΜ)的峰面积(As)已知，且化合物k的峰面积(Ak)与化合物s的峰面积(As)相等，化合物k 的浓度(Ck)即等于代表化合物的浓度(Cs)。
[0040] 计算每个家族中每个色谱峰重构所需的比例。
[0041]
[0044] 用手动移液器或者自动化仪器按步骤3的比例对各个色谱峰进行组合，从而完成 对提取物的改造。
[0045] 步骤4:应用高通量筛选技术对改造后的天然化合物库进行扫描并找到活性化合 物。
[0046] 步骤5:对步骤1中药物的制备方法进行改进，使得步骤1中提取物中含量过少的活 性化合物的含量增加，使得骤1中提取物中因含量过大的活性化合物的含量减少，从而得到 重新组合的药物提取物。
[0047] 本发明的效果包括:全面筛选药物提取物中的活性成分，避免活性成分在原提取 物中含量过少而导致的漏筛和无活性成分因含量过大而导致的假阳性结果，使成分未知、 含量未知且参差不齐、响应有高有低的中药原提取物转变为成分清楚、含量相对已知并且 均匀、响应良好的筛选化合物库，从而可以更好的与高通量筛选技术兼容。更重要的是，该 方法可以全面揭示化学家族内和家族间组合的多成分相互作用关系，是对现代中药活性成 分筛选体系的重要补充。
[0048] 通过本发明得到重新组合的药物提取物，也就是如下具有活性的新的药物组合 物。
[0049] 本发明涉及一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由如下丹参酮类化合物中的一 种、两种、或多种组成;丹参酮类化合物为：15,16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮 IIA；
[0050] 本发明涉及一种促进凝血酶活性的药物组合物，由如下人参皂苷类化合物中的一 种、两种、或多种组成;人参皂苷类化合物为:人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参 皂苷Rb。
[0051] 本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参 皂苷类化合物;丹参酮类化合物由以下的一种、两种、或多种组成：15，16_二氢丹参酮、隐丹 参酮、丹参酮I、丹参酮IIA;人参皂苷类化合物由以下的一种、两种、或多种组成：人参皂苷 Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。
[0052] 本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹酚酸A、丹参酮类化 合物、人参皂苷类化合物;丹参酮类化合物由如下一种、两种、或多种组成：15，16_二氢丹参 酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA;人参皂苷类化合物由如下一种、两种、或多种组成:人参 皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。
[0053] 本发明涉及一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由丹参酮类化合物中的一种、两 种、或多种组成;丹参酮类化合物为：