或多种组成;人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人 参皂苷Rd、人参皂苷Rb;高效液相检测到峰面积:各皂苷类化合物面积分别为218-284。
[0161] 实施例8
[0162] -种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参皂苷类化合 物；
[0163] 由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹 参酮I、丹参酮ΠΑ;以浓度范围表示91.61-99.49μΜ。
[0164] 由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成;人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人 参皂苷Rd、人参皂苷Rb;以浓度范围表示81.04-105.58μΜ。
[0165] 实施例9
[0166] -种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参皂苷类化合 物、丹酚酸A;
[0167] 由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹 参酮I、丹参酮IIA;高效液相检测到峰面积:各丹参酮类化合物面积分别为721-783;
[0168]由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成;人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人 参皂苷Rd、人参皂苷Rb;高效液相检测到峰面积:各皂苷类化合物面积分别为218-284。 [0169]丹酚酸A的面积分别为2534。
[0170] 实施例10.
[0171] -种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参皂苷类化合 物、丹酚酸A;
[0172] 丹参酮类化合物由如下一种、两种、或多种组成；15,16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹 参酮I、丹参酮ΠΑ;浓度范围表示91.61-99.49μΜ。
[0173] 人参皂苷类化合物由如下一种、两种、或多种组成;人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人 参皂苷Rd、人参皂苷Rb;以浓度范围表示81.04-105.58μΜ。
[0174] 丹酚酸Α，以浓度表示为110.08μΜ。
[0175] 实施例11.
[0176] -种具备抑制凝血酶活性的丹酚酸Α，其丹酚酸Α被溶解于磷酸缓冲液中。磷酸缓 冲液的制备方法是:精密称取1.9120g磷酸二氢钾、13.8920g磷酸氢二钾(三水)及乙二胺四 乙酸(EDTA)37.24mg，加入超纯水约960mL超声促溶，取出，定容至1000mL即得含75mmol/L磷 酸根离子、200μmol/LEDTA，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0177] 表1丹七方中的化合物结构鉴定
[0178]
[0179] a:没有检测到该化合物母离子。
[0180]表2丹七方中的18个化合物在半制备柱上的保留时间、收集时间窗、收集体积以 及峰面积
[0181]
[0182] 表3丹七方提取物与改造后化合物库的峰面积比较
[0183]
[0184] 表4丹七方中化合物的凝血酶抑制活性
[0185]
[0186] a检测浓度为125μΜ。
[0187] b没有检测到IC50。
[0188] 表5丹参酮IIA和15,16-二氢丹参酮I抗凝血酶的加和作用
[0189]
[0190] 表6 15,16-二氢丹参酮I和隐丹参酮抗凝血酶的加和作用
[0191]
[0192] 表7丹参酮IIA和隐丹参酮抗凝血酶的加和作用
[0193]
[0194] 表8 PPT型人参皂苷对丹参酮抑制凝血酶活性的拮抗作用
[0195]
[0196] 表9 ΡΗ)型人参皂苷对丹参酮抑制凝血酶活性的中和及反转作用
[0197]
[0198] a当皂苷和丹参酮的比例为1:1(1皂苷+ 1丹参酮）时，混合物的凝血酶抑制率为 0%-10%。即皂苷的促进作用中和了丹参酮的抑制作用。
[0199] b当皂苷和丹参酮的比例为1:1(1皂苷+1丹参酮）时，混合物的凝血酶抑制率为负 数。即皂苷的促进作用反转了丹参酮的抑制作用。
[0200] 表l〇a丹酚酸(丹参素和原儿茶醛)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相 互作用
[0201]
[0202] 表10b丹酚酸(迷迭香酸和紫草酸)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相 互作用
[0203]
[0204] 表10c丹酚酸(丹酚酸B和丹酚酸A)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相 互作用
[0205]
【主权项】
1. 一种揭示药物活性成分及其组合的方法，包括下述步骤： 步骤1:对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物归属 于不同的化学家族； 步骤2:对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积； 步骤3:从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表在同 一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该标准 看齐，对天然化合物库进行改造； 步骤4:应用高通量筛选技术对改造后的天然化合物库进行扫描并找到活性化合物； 步骤5:围绕活性化合物所在的化学家族进行组合，选用指标或模型评价家族内和家族 间组合的相互作用关系，这种关系可能是拮抗、相加、协同或者无明显相互关系。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述结构相似性为在官能团、药效团、分子量等方面具有的相似性； 所述药物提取物的来源包括而不限于:植物提取物、动物提取物、微生物提取物、真菌 提取物、矿物提取物等天然产物。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物结构鉴定为基于质谱的化合物分 子量和特征碎片离子比对或基于核磁共振技术、红外光谱、紫外光谱的化合物结构解析;所 述色谱分离为分析型、半制备型或制备型的高效液相色谱。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱图进行分解为通过色谱图的保留时 间设置时间窗，以色谱峰为单位的馏分收集。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述容易获取的化合物为在天然产物中丰度 高且易制备纯化的或者市场上价格便宜的标准品。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重新组合为按照规则，通过手动移液器 或自动化仪器对各个馏分进行混合。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量筛选技术为多孔道酶标仪检测或 基于革E细胞和祀蛋白的亲和色谱筛选;所述指标或模型为Combination Index理论、Bliss independence模型、Loewe additivism模型或者剂量依赖性的相互作用趋势。8. 根据权利要求1所述一种揭示药物活性成分及其组合的方法，其特征在于，所揭示的 丹七方中有联合用药价值的组合关系包括丹参酮类化合物对凝血酶抑制的加和作用和人 参皂苷类对丹参酮类抗凝血酶活性的拮抗作用。9. 一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组 成;丹参酮类化合物为：15,16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA;或； 一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组 成;人参皂苷类化合物为:人参皂苷Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb;或； 一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物； 由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成;丹参酮类化合物为：15,16-二氢丹参 酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ΠΑ; 由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷类化合物为：人参皂苷 Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。 一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含:丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物、 丹酸酸A; 由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成;丹参酮类化合物为：15,16-二氢丹参 酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ΠΑ; 由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷类化合物为：人参皂苷 Rgl、人参皂苷Rhl、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。10. -种具备凝血酶抑制活性的丹酚酸A的组合物，其组成是:丹酚酸A、磷酸缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种揭示药物活性成分及其组合的方法，包括如下步骤：对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物分成不同的化学家族；天然化合物库改造；对改造后的天然化合物库进行筛选并找到活性分子；围绕活性分子所在的化学家族进行组合，标评价化学家族内和家族间的相互作用关系，可发现被传统方法所忽略的微量活性成分及其组合间复杂相互作用，操作简便、经济、绿色、适用性强。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN105510495
【申请号】CN201510694967
【发明人】李萍, 杨华, 宋慧鹏, 邬思琪, 刘鄂湖
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年10月22日