豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制备方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制 备方法。
【背景技术】
[0003] 世界粮农组织(FA0)报告，全球每年约有25%的农作物遭受真菌及其真菌毒素污 染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养价值和经济价值，由此估算，全球每年因真菌 毒素污染而造成的直接及间接损失将可能达到数百亿美元。
[0004] 在目前已知的真菌毒素中，串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)是一种重要的植 物病原菌，危害小麦、玉米、水稻、蔬菜等农作物，造成严重的减产，所产生的真菌毒素玉米 赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致崎作用。目前针对真菌毒素的检测，我国主要为理化方 法，只能检测到已经产生的毒素，对于已被污染但尚未产生毒素的高风险食品却束手无策， 更无法溯源，而且由于真菌的形态相似性及产毒真菌的产毒状况的复杂性，目前各菌种保 藏中心提供的标准菌株基本信息不全，基本不涵盖产毒信息，使检验工作难以获得真正的 阳性标准样品。
[0005] 另一方面，目前已研制的分类定级国家标准样品多数溯源至相应的文字标准，生 物类定性标准样品多数溯源至公认的测试方法，部分国家标准样品没有溯源性的描述。对 2010年~2015年批准的146项分类定级国家标准样品溯源性描述的调查表明：无溯源性描 述内容的35项，溯源至测试方法标准的102项，溯源至核酸序列的22项，溯源至产品标准的5 项，溯源至计量基准的1项，溯源至权威专家的1项。分类定级国家标准样品溯源性描述的状 况说明人们对这类标准样品的溯源性认识和理解上处于比较混乱的阶段，还没有一个统一 的规范。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种豆粉中生物和产毒信息明确的串珠 镰刀菌实物定性标准样品，同时采用标准物质分类定级理论，建立对豆粉中串珠镰刀菌实 物定性标准样品的定值溯源参照系与参照指标。本发明的另一目的是提供一种豆粉中串珠 镰刀菌定性标准样品的制备方法。
[0007] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是:一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样 品，其特征在于:所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品包含的序列为： 内转录间隔区基因 （ITS )序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGITTACTCCCAAA CCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCC CTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTG GTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGT AGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA； 核糖体 rRNA 18S基因（18S)序列：GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGT ATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGG ATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAAC CAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTC AAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCT CGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATC CCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAA GTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGG CCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAAT TAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTT GGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTG GATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATC GAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCC GTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATT GACGGAAG； 核糖体rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGC ACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGACTTCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGT TATAGCCCGTTGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAAC GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 伏马菌素合成基因(FUM)序列： GTCCTACGCGATACATCCCACCACAATTGACCACTGCCTCCAACTCTTCTTCCCTGCTAGCTGTGACGGAATC TTTTACCGAGCCGAGAAACTATGCGTTCCAACAGCAATCGGACGCTTGTATCTTGCGGATGGGAAGCTGTGGGAGGT AGAGGGTGCCCGAGCTGAAGCATTGGCCGCGACAAACTCCGGGGGCTCGATTTCTGGGGCCGCTATCGTGGTGTCCC AACATGACTCTGTCCTGCTCTCTCTGGAGGATGGAAAATTCTCCCCACTGGAAATGGATCTTGGAGGGGAAGGAAAC GCAGATTTGGTTGGTGCGGCACGTCTCGAATGGAAACCAAACTTGGACTTTGCCGATATGCATAGCCTTGTTCGCCC AAGTCATGGATCTATGAACGACGGCCCCGAGCTTGATC〇
[0008]进一步地，所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的溯源指标如下表所示： 表1豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品溯源指标
[0009] 进一步地，所述产毒基因簇为FUM基因。
[0010] 进一步地，所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品为真空冻干粉，可用于食品、饲料 中镰刀菌的定性检测，也可用于质量控制，产品在〇_4°C贮存，两年内稳定，常温运输。
[0011] -种根据所述的豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的制备方法，其特征在于:包括 以下步骤： 第一步:培养串珠镰刀菌ACCC36127至对数生长期，采集孢子加入到10-30 mL的0.5%的 豆粉水溶液中，目标菌添加量约为2*105CFU/mL; 第二步:样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将混匀好的上述溶液加入到总体 的豆粉水溶液中，重复混合步骤； 第三步:将步骤二中制备好的菌液分装〇.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试 冻干机中低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉。
[0012] 进一步地，所述第三步中的冷冻工艺参数如下： 1) 预冷阶段:隔板温度5°C; 2) 冷冻阶段:设置隔板温度为10°C，每个阶段降低10°C，至_50°C，每个温度阶段运行时 间分别为lh; 3) 主干燥阶段:①隔板温度_50°C，运行时间0.5h，真空度0.2mbar;耍隔板温度-40°C， 运行时间7h，真空度0 · 4mbar 隔板温度-35°C，运行时间7h，真空度0 · 6mbar 隔板温度- 25°C，运行时间5h，真空度0.8mbar;⑤隔板温度-15°C，运行时间4h，真空度1. Ombar 隔板 温度_5°C，运行时间2h，真空度1.2mbar; 4) 二次干燥阶段:①隔板温度0°C，运行时间3h，真空度O.OOlOmbar; ?福板温度15°C， 运行时间3h，真空度0.001 Ombar; #隔板温度25°C，运行时间3h，真空度0.001 Ombar。
[0013] 本发明是在标准样品定性测试理论的研究成果基础上，在国家生物安全标准样品 体系框架下，研究解决上述实际工作中遇到的问题，以来源明确的产毒真菌串珠镰刀菌模 拟自然污染豆粉样品，制备一种生物及产毒信息完整的串珠镰刀菌实物标准样品，根据串 珠镰刀菌具有分类学意义的技术指标，解决了串珠镰刀菌实物标准样品溯源参照系与参照 指标问题，并应用于本标准样品的定值以及均匀性、稳定性分析中，获得具有真正溯源意义 的串珠镰刀菌实物标准样品，是国内首次分类定级标准样品的研制，具有重要的意义。
【附图说明】
[0014] 图1为豆粉中串珠镰刀菌实物定性标准样品的制备流程图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。 实施例
[0016] 采用标准物质分类定级理论，建立对豆粉中串珠镰刀菌实物定性标准样品的定值 溯源参照系与参照指标，包括以下步骤： 第一步:标准物质定值溯源参照系的建立： (1)串珠镰刀菌的分类地位 污染的豆粉样品中一个镰刀菌的分类地位(taxon)特性值为串珠镰刀菌(种），其中，用 于分类的特性是镰刀菌的分类地位，该镰刀菌(被测对象）的特性值为串珠镰刀菌(种）。镰 刀菌（属）的分类地位特性值集包含直孢组、李瑟组、拟穗霉组、枝孢组、砖红组、美丽组、马 特组、蛛丝组、表球组、嗜蚧组、膨孢组和色变组12个组一级的子集，李瑟组子集中包括串珠 镰刀菌、增殖镰刀菌、亚粘团串珠镰刀菌和花腐镰刀菌。因此，镰刀菌(属）的分类地位特性 子集具有典型的层级结构（属一组一种），同级（组或种)子集之间具有并列互斥关系，串珠 镰刀菌被"李瑟组"包容并均为封闭类。
[0017] ( 2)串珠镰刀菌溯源参照系的理论指标 "分生孢子形态"是串珠镰刀菌"分类地位"特性的一个子特性，它与菌落形态、菌丝形 态等子特性构成其上级子特性"形态特性"；而"形态特性"、"生化特性"、"遗传学特性"等构 成"分类地位"这个分类特性；因此，以上与之相关的子特征均视为串珠镰刀菌溯源参照系 的理论指标。
[0018] (3)串珠镰刀菌溯源参照系的指标的确认 采集5株来自不同菌种保藏中心的（ACCC36127、CGMCC 3.4759、ACCC37123、