CICC40363、ACCC30133)菌落特性、显微结构、遗传序列（18S基因、28S基因、ITS基因及产毒 基因序列）、化学特性(产玉米赤霉烯酮毒素）的分析数据，见表2,结合4种近缘种的比对分 析，确认串珠镰刀菌溯源参照系的指标为：1.菌落颜色，2.菌落直径，3.小型分生孢子数量， 4.小型分生孢子链生，5.分生孢子形状，6.分生孢子大小，7.生化指标，8.遗传序列。
[0019] 表2不同串珠镰刀菌菌株特性比对分析
豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的具体指标如下表所示： 表3豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品指标
[0020]所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的制备方法，包括以下步骤： 第一步:培养串珠镰刀菌ACCC36127至对数生长期，采集孢子加入到20 mL的0.5%的豆 粉水溶液中，目标菌添加量约为2*105CFU/mL; 第二步:样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将混匀好的上述溶液加入到总体 的豆粉水溶液中，重复混合步骤； 第三步:将步骤二中制备好的菌液分装〇.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试 冻干机中低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉， 冷冻工艺参数如下： 1) 预冷阶段:隔板温度5°c; 2) 冷冻阶段:设置隔板温度为10°C，每个阶段降低10°C，至_50°C，每个温度阶段运行时 间分别为lh; 3 )主干燥阶段:①隔板温度-50°C，运行时间0.5h，真空度0.2mbar趨隔板温度-40°C， 运行时间7h，真空度0.4mbar;@·板温度-35°C，运行时间7h，真空度0.6mbar;④隔板温度-25°C，运行时间5h，真空度0.8mbar 隔板温度-15°C，运行时间4h，真空度1. Ombar;⑩隔板 温度_5°C，运行时间2h，真空度1.2mbar。
[0021] 4)二次干燥阶段:?隔板温度0°C，运行时间3h，真空度O.OOlOmbar; #隔板温度 15°C，运行时间3h，真空度O.OOlOmbar;?)隔板温度25°C，运行时间3h，真空度O.OOlOmbar。
[0022] 所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品为真空冻干粉，可用于食品、饲料中串珠镰 刀菌的定性检测，也可用于质量控制，产品在〇_4°C贮存，两年内稳定，常温运输。
[0023] 由8家实验室（辽宁出入境检验检疫局、大连出入境检验检疫局、河南出入境检验 检疫局、山东农业大学生命科学院、辽宁师范大学生命科学学院、山东出入境检验检疫局、 吉林出入境检验检疫局、沈阳出入境检验检疫局)对制备出的豆粉中串珠镰刀菌定性标准 样品定值。定值采用串珠镰刀菌溯源参照系的8个指标，测试方法采用GB/T 4789.16 - 2003,每个定值实验室测试5支标准样品，数值取均值;测序采用2家测序公司（铂尚生物科 技有限公司和北京六合华大基因科技有限公司）完成，所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样 品的序列为： 内转录间隔区基因（ITS )序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGITTACTCCCAAA CCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCC CTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTG GTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGT AGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA； 核糖体 rRNA 18S基因（18S)序列：GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGT ATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGG ATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAAC CAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTC AAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCT CGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATC CCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAA GTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGG CCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAAT TAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTT GGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTG GATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATC GAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCC GTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATT GACGGAAG； 核糖体rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGC ACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGACTTCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGT TATAGCCCGTTGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAAC GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 伏马菌素合成基因(FUM)序列： GTCCTACGCGATACATCCCACCACAATTGACCACTGCCTCCAACTCTTCTTCCCTGCTAGCTGTGACGGAATC TTTTACCGAGCCGAGAAACTATGCGTTCCAACAGCAATCGGACGCTTGTATCTTGCGGATGGGAAGCTGTGGGAGGT AGAGGGTGCCCGAGCTGAAGCATTGGCCGCGACAAACTCCGGGGGCTCGATTTCTGGGGCCGCTATCGTGGTGTCCC AACATGACTCTGTCCTGCTCTCTCTGGAGGATGGAAAATTCTCCCCACTGGAAATGGATCTTGGAGGGGAAGGAAAC GCAGATTTGGTTGGTGCGGCACGTCTCGAATGGAAACCAAACTTGGACTTTGCCGATATGCATAGCCTTGTTCGCCC AAGTCATGGATCTATGAACGACGGCCCCGAGCTTGATC〇 [0024]定值结果汇总见表4: 表4合作奋估结里
以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体 实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构 思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品，其特征在于:所述豆粉中串珠镶刀菌定性标 准样品包含的序列为：2. 根据权利要求1所述的豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品，其特征在于:所述豆粉中串 珠镶刀菌定性标准样品的溯源指标如下表所示： 表1豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品溯源指标〇3. 根据权利要求2所述的豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品，其特征在于:所述产毒基因 簇为FUM基因。4. 根据权利要求1或2所述的豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品，其特征在于:所述豆粉 中串珠镶刀菌定性标准样品为真空冻干粉，可用于食品、饲料中镶刀菌的定性检测，也可用 于质量控制，产品在〇-4°C胆存，两年内稳定，常溫运输。5. -种根据权利要求1或2所述的豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品的制备方法，其特征 在于:包括W下步骤： 第一步:培养串珠镶刀菌ACCC36127至对数生长期，采集抱子加入到10-30 mL的0.5%的 豆粉水溶液中，目标菌添加量约为2*105CFU/mM 第二步:样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将混匀好的上述溶液加入到总体 的豆粉水溶液中，重复混合步骤； 第Ξ步:将步骤二中制备好的菌液分装0.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试 冻干机中低溫真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉。6. 根据权利要求5所述的豆粉中串珠镶刀菌定性标准样品的制备方法，其特征在于:所 述第Ξ步中的冷冻工艺参数如下： 1) 预冷阶段:隔板溫度5°C; 2) 冷冻阶段:设置隔板溫度为10°C，每个阶段降低10°C，至-50°C，每个溫度阶段运行时 间分别为化； 3) 主干燥阶段:致隔板溫度-50°C，运行时间0 .化，真空度0.2mbar;廢隔板溫度-40°C， 运行时间化，真空度0.4mbar;敎隔板溫度-35°C，运行时间化，真空度0.6mbar;盛隔板溫度- 25°C，运行时间化，真空度0.8mbar ;#隔板溫度-15°C，运行时间地，真空度1. Ombar;感隔板 溫度-5°C，运行时间化，真空度1.2mbar; 4) 二次干燥阶段:適隔板溫度0°C，运行时间化，真空度O.OOlOmbar;感隔板溫度15°C， 运行时间化，真空度0.0 OlOmbar;壞隔板溫度25°C，运行时间化，真空度0.0 OlOmbar。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制备方法。本发明根据串珠镰刀菌具有分类学意义的技术指标，解决了串珠镰刀菌实物标准样品溯源参照系与参照指标问题，并应用于本标准样品的定值分析中，在标准样品定性测试理论的研究成果基础上，在国家生物安全标准样品体系框架下，以来源明确的产毒真菌串珠镰刀菌模拟自然污染豆粉样品，采集对数生长期的串珠镰刀菌ACCC36127孢子污染无菌豆粉，混合仪拍打混合，分装，冻干制备出一种生物及产毒信息完整的串珠镰刀菌实物标准样品，获得具有真正溯源意义的串珠镰刀菌实物标准样品，是国内首次分类定级标准样品的研制，具有重要的意义。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN105547788
【申请号】CN201610098384
【发明人】蒋丹, 刘淑艳, 万超, 丁健, 白璐, 郑江
【申请人】蒋丹, 刘淑艳, 万超, 丁健
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月23日