7] 图4为4-ΗΗΕ线性标准曲线；
[0028] 图5为4-ΗΝΕ线性标准曲线。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0030] 实施例1
[0031](一）取lg油样，加入10mL蒸馏水(含有10yL的10mg/mL ΒΗΤ溶液），涡旋2min，超声 3min，重复祸旋、超声3次进行萃取，之后4500rpm转速下离心10min后收集水层，然后再对油 层重复上述加蒸馏水、涡旋、超声的操作一次，将两次收集的水层合并，得到含有待检测物 4-ΗΗΕ、4-HNE的澄清溶液。
[0032](二）澄清溶液过Supelclean? ENVI-18萃取柱：
[0033] 首先用3mL甲醇活化C18萃取柱，再用3mL水平衡C18萃取柱。
[0034] 然后将上一步骤得到的含有待检测物4-HHE、4_HNE的澄清溶液上样，上样结束后， 先用15mL石油醚洗脱非极性物质，之后利用3mL甲醇水混合溶液（甲醇、水体积比80: 20)将 目标物洗脱入2mL的容量瓶，氮气吹扫去除石油醚，之后再用上述甲醇水混合溶液定容至 2mL，对洗脱液进行浓缩，然后将浓缩液过0.22μπι的微孔过滤膜，待用。
[0035] (三)利用高效液相色谱进行分析，利用外标法进行定量；
[0036] (1)高效液相色谱（Surveyor plus，美国Thermo公司）的流动相为:分别以水和甲 醇为流动相A和B，以流速250yL/min进行梯度洗脱，在最初的2min内，水和甲醇的体积比是 70: 30,在2~20min内，水和甲醇的体积比线性变化为0:100，100%甲醇维持5min，25.1~ 3〇11^11内水与甲醇的比例是70 :30。
[0037] (2)高效液相色谱分析中所用的色谱柱为反相C18柱(4.6 X 150mm，2.7μπι，美国新 一代核-壳型Halo色谱柱）。
[0038] (3)高效液相色谱的检测器为光电二极管阵列检测器，检测波为225nm，柱温为30 °C，进样量为5yL。油脂样品的谱图如图3所示。
[0039] (4)制作线性标准曲线：分别配制浓度为0.4、1、4、10、20、40yg/mL的4-HHE以及 0.4、4、10、20、40yg/mL的4-HNE标准溶液，经HPLC检测(HPLC检测条件与对待检测物的检测 条件相同）后，反式-4-羟基-2-己烯醛、反式-4-羟基-2-壬烯醛标准品的谱图如图2所示。 [0040]根据进样浓度和对应色谱峰制成线性标准曲线，图4为4-HHE线性标准曲线，图5为 4-HNE线性标准曲线。
[0041 ] 4-HHE 的线性标准曲线方程:y = 601004x+215586，R2 = 0 · 9996
[0042] 4-HNE 的线性标准曲线方程:y = 243770x+l 76349，R2 = 0 · 9973
[0043] 上式中，y为峰面积，单位为mAU，x为4-HHE或4-HNE标准溶液的浓度，单位为μg/ml。 [0044](四）检测限、回收率、精密度
[0045] 本发明检测方法4-HHE、4-HNE精密度分别是1.48 %以及1.36 % ; 4-HHE、4-HNE的检 出限分别为〇 · 〇486yg/mL，0 · 0129yg/mL;定量限分别是0 · 1458yg/mL，0 · 043 lyg/mL。
[0046] 为验证本发明检测方法的准确性，向大豆油中加入定量的4-HHE、4_HNE，再用本发 明方法提取油脂中的4-HHE、4-HNE，再进行4-HHE、4-HNE的净化，通过HPLC进行检测，并得出 油脂中的4-HHE、4-HNE含量，与实际添加的4-HHE、4-HNE量进行比较，得到大豆油中4-HHE、 4-HNE的回收率，表1是大豆油中4-HHE、4-HNE的回收率。
[0047] 表1大豆油中4-HHE、4_HNE的回收率
[0049] 从表1可以看出，4-HHE、4-HNE的加标回收率分别在89.11~91.58%，71.83~ 79.40 % 之间。
[0050] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，其特征在于，包括以下步骤： 提取油脂中的4-HHE、4-HNE: 取油脂，加入含有BHT的蒸馏水，涡旋、超声后高速离心后收集水层，然后再对油层重复 上述加蒸馏水、涡旋、超声的操作一次，将两次收集的水层合并，得到含有待检测物4-HHE、 4-HNE的澄清溶液； 用萃取柱进行4-HHE、4-HNE的净化： 用甲醇活化C18萃取柱，再用水平衡C18萃取柱，将含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶 液流经C18萃取柱，上样结束后，先用石油醚洗脱非极性物质，之后利用甲醇水混合溶液将 目标物洗脱，氮气吹扫去除石油醚，洗脱液定容，再对洗脱液进行浓缩，然后将浓缩液过 0 · 22μπι的微孔过滤膜，待用； 利用HPLC进行分析，利用外标法进行定量： 上述处理后浓缩液经HPLC检测后，根据4-HHE、4-ΗΝΕ的线性标准曲线，计算油脂中4-ΗΗΕ、4-ΗΝΕ 的含量。2. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测油脂中4-ΗΗΕ和4-ΗΝΕ的方法，其特征 在于，所述的甲醇水混合溶液中甲醇、水体积比为80:20。3. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测油脂中4-ΗΗΕ和4-ΗΝΕ的方法，其特征 在于，4-HHE、4-ΗΝΕ的线性标准曲线的制作方法为:分别配制浓度为0.4~40yg/mL的4-ΗΗΕ、 4-HNE标准溶液，经HPLC检测后，根据进样浓度和对应色谱峰制成线性标准曲线， 其中，4-HHE、4-HNE标准溶液与待测样品的HPLC检测参数相同。4. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，其特征 在于，HPLC检测工艺为:分别以水和甲醇为流动相A和流动相B，以流速0.25~1. OmL/min进 行梯度洗脱，在最初的2min内，水和甲醇的体积比是70:30，在2~20min内，体积比线性变化 为0:100，100%甲醇维持5min，25.1~30min内水与甲醇的比例是70:30。5. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，其特征 在于，HPLC检测使用的检测器为光电二极管阵列检测器，检测波为220-225nm，柱温为30°C， 进样量为2~5yL。6. 根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，其特征 在于，HPLC检测使用的色谱柱为反相C18柱。
【专利摘要】本发明涉及一种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，包括以下步骤：取油脂，加入含有BHT的蒸馏水，涡旋、超声后高速离心后收集水层，得到含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液；用甲醇活化C18萃取柱，再用水平衡C18萃取柱，将含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液流经C18萃取柱，上样结束后，先用石油醚洗脱非极性物质，之后利用甲醇水混合溶液将目标物洗脱，氮气吹扫去除石油醚，洗脱液定容，再对洗脱液进行浓缩，然后将浓缩液过0.22μm的微孔过滤膜，待用；上述处理后浓缩液经HPLC检测后，根据4-HHE、4-HNE的线性标准曲线，计算油脂中4-HHE、4-HNE的含量。与现有技术相比，本发明的优点在于能够简单方便的定量出油脂中4-HHE、4-HNE的含量。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105572253
【申请号】CN201510969503
【发明人】吴时敏, 华宏英
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月21日